携带NMU2R shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其评价

摘要

构建稳定表达NMU2R shRNA的重组腺相关病毒载体,制备并纯化靶向性沉默NMU2R表达的高滴度重组腺相关病毒.首先设计合成NMU2R shRNA,退火形成双链与pAAV-ZsGreen-shRNA质粒BamH I和Hind III双酶切产物相连接构建形成质粒pAAV-ZsGreen-rNMU2R shRNA,经双酶切和测序鉴定证实,重组质粒克隆正确,将重组质粒转染到AAV-293包装细胞中包装成腺相关病毒载体,成功制备重组腺相关病毒rAAV5-ZsGreen-rNMU2R shR-NA,经测定纯化所得rAAV5病毒滴度为1×1012 vg/mL.最后将rAAV5-ZsGreen-rNMU2R shRNA感染大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12,检测NMU2R shRNA基因沉默效果,利用空病毒载体pAAV-ZsGreen-shRNA作对照,Real-time PCR及Western Blot方法测得NMU2R mRNA及蛋白表达水平与对照组相比显著下降.综上,成功构建了高滴度携带NMU2R shRNA重组腺相关病毒载体rAAV5-ZsGreen-rNMU2R shRNA.