重组腺相关病毒

摘要： 目的 胆碱能系统损伤是阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)的重要发病机制,但单纯应用拟胆碱药物治疗AD效果不理想,这可能与其复杂的网络通路有关.本研究旨在建立一种基底前脑Meynert基底核(nucleus basalis of Meynert,NBM)催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因沉默的大鼠模型,评价OXTR敲低对认知行为和胆碱能通路的影响,为研究AD的复合治疗靶点提供基础.方法 (1)利用重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的基因干扰技术,将不同稀释倍数的rAAV9-EGFP-Oxtr-shRNA(OXTR-shRNA)病毒注射至大鼠基底前脑NBM区,分别于注射后2、3、4、5周,观察各组脑组织NBM区EGFP荧光表达,比较病毒感染效果,确定最佳的病毒感染剂量与感染时间进行下一步实验.(2)将大鼠随机分为假手术(Sham)组、阴性对照病毒(Con-shRNA)组、OXTR沉默(OXTR-shRNA)组,Morris水迷宫和避暗实验检测大鼠的空间学习记忆和恐惧记忆;免疫荧光染色检测NBM区OXTR蛋白表达水平,评估OXTR沉默效果;ELISA法检测大鼠皮质区乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)水平变化;免疫荧光染色检测皮质区乙酰胆碱转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)的表达.结果(1)OXTR-shRNA的感染效果呈剂量和时间依赖性;(2)OXTR-shRNA组大鼠在水迷宫实验中的逃避潜伏期高于假手术组和Con-shRNA组;在避暗实验的巩固阶段,OXTR-shRNA组大鼠进入暗箱的潜伏期低于假手术组和Con-shRNA组;免疫荧光染色结果显示OXTR-shRNA组NBM区OXTR表达减少;OXTR-shRNA组皮质中Ach水平以及ChAT表达低于另外两组.结论 成功建立了一种基底前脑OXTR敲减动物模型,该模型具有学习记忆障碍、胆碱能系统损伤的表型,将为认知功能障碍相关疾病的研究提供依据.

摘要： 采用酶联免疫吸附测定(ELISA)、实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)和转导方法对重组腺相关病毒(rAAV)的衣壳滴度、基因组滴度、转导滴度进行定量,并比较衣壳滴度/基因组滴度(P/GC)和基因组滴度/转导滴度(GC/TU).实验结果表明:3批rAAV的平均衣壳滴度为3.65×1013 P ? mL-1,平均基因组滴度为8.67×1011 GC·mL-1,平均转导滴度为9.85×109 TU ? mL-1,P/GC平均值为41.70,GC/TU平均值为88.20,P/GC和GC/TU平均值接近于AAV2标准品,说明文中方法的制备工艺成熟、稳定,制备的rAAV感染活性较高.

摘要： 目的 探究超氧化物歧化酶1(SOD1)的SOD1G41S和SOD1G41D基因对小鼠运动功能的影响.方法 实验小鼠分为对照组(转染空的重组腺相关病毒)、SOD1WT组、SOD1G41S组和SOD1G41D组,均n=12.利用重组腺相关病毒基因过表达的特点,构建携带SOD1WT、SOD1G41S和SOD1G41D的重组腺相关病毒,分别注射至小鼠双侧侧脑室和鞘内,建立转基因小鼠模型.1个月后测量对照组、SOD1WT组、SOD1G41S组和SOD1G41D组小鼠的体重,并通过握力测试、悬尾实验、转棒疲劳实验和旷场实验评估各组小鼠的运动功能.结果 成功构建了携带SOD1WT、SOD1G41S、SOD1G41D的重组腺相关病毒,不同相关病毒处理1个月对小鼠的体重无明显影响.握力测试显示SOD1G41S组和SOD1G41D组握力值显著低于SODWT组(P0.05).转棒疲劳实验中,SOD1G41D组坠落潜伏期显著低于SOD1WT组和SOD1G41S组(P0.05).各组实验小鼠在中心区域停留时间比较差异无统计学意义(均P<0.05).结论?SOD1WT、SOD1G41S和SOD1G41D在中枢神经系统过表达均能提高重组腺相关病毒模型小鼠的运动能力,其能力大小依次为SOD1WT、SOD1G41S和SOD1G41D.

摘要： 目的 探讨人TSHR A亚单位重组腺相关病毒(rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen)能否在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)及小鼠体内表达及其表达效率.方法 以rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染NIH3T3,Western blotting检测目的基因蛋白表达;分别以不同剂量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen注射雌性BALB/c小鼠,免疫荧光法检测TSHR A亚单位蛋白在各个器官的表达,免疫放射法测定血清TSHR抗体(TRAb)滴度.结果 感染rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreenNIH3T3细胞48 h及72 h后均有目的蛋白表达,与24 h相比较明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);荧光显微镜下可见腿部骨骼肌、心肌、肝脏、脾脏有不同程度的TSHR289表达;放免法测定结果显示,注射剂量越大,血清TRAb抗体滴度越高,但只有高剂量和对照组之间有统计学差异(P<0.05).中剂量和高剂量肌内注射在第4、8、12周小鼠体内均有抗体反应,但以第4周最强,4～8周逐渐减弱,抗体持续时间可达12周.结论 rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen可在体外及小鼠体内高效表达,并具有较强免疫原性,可能成为制备Graves病模型的一种重要手段.

摘要： 目的 构建小鼠过表达GJB1基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,建立一种小鼠肾脏过表达GJB1基因的动物模型.方法 采用PCR扩增制备小鼠GJB1基因片段,利用基因重组技术构建含GJB1基因的重组质粒,将携带小鼠GJB1基因的腺相关病毒(AAV)穿梭质粒与pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞,通过选择培养基筛选出同源重组的阳性克隆获得rAAV.将30只成年C57BL/6J雄性小鼠随机分为5组各6只(W1组、W2组、W3组、W4组及空白对照组),经尾静脉将rAAV注射到W1～W4组小鼠体内,分别于注射后1周、2周、3周、4周取其心脏、肝脏、肾脏组织行PCR检测GJB1 mRNA的表达情况,并经石蜡包埋切片后采用免疫组织化学法检测Cx32的表达.结果 含GJB1基因的rAAV被成功构建.随着注射后时间的延长,小鼠肾脏组织GJB1基因转录及Cx32蛋白表达强度均逐渐增强,与空白对照组比较差异有统计学意义(P均0.05).结论 采用rAAV技术可成功构建肾脏过表达GJB1基因的小鼠模型,这对深入研究GJB1基因在肾损伤中的作用机制、评估以GJB1为治疗靶点的药物疗效等具有重要的科学价值和临床意义.

摘要： 目的 探讨携带甲胎蛋白(AFP)的重组腺相关病毒(rAAV)感染树突状细胞(DCs)对肝癌细胞株SMMC-7721的体外杀伤作用,为肝癌非手术治疗提供方法.方法 首先确定AFP基因序列并合成AFP基因,将其转染至重组腺相关病毒rAAV,之后将转染AFP的rAAV感染树突状细胞,并将感染rAAV的DC与SMMC-7721共同培养,同时设未感染rAAV的DC作为对照组,用MTT法检测rAAV-DC及DC对SMMC-7721的杀伤活性.结果 感染rAAV的DC对SMMC-7721的杀伤活性为89.00％,DC对SMMC-7721的杀伤活性为75.19％,两者比较有差异(P＜0.05).结论 携带AFP的rAAV感染DC后,能明显增强DC对SMMC-7721的杀伤活性.

摘要： 重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体与其他病毒载体相比,具备感染能力强、可持续表达目的基因、无致病性和非基因组整合等优点,已成为体内基因治疗的主要病毒载体.目前,国际上已有3个rAAV相关的基因治疗产品获批上市,另有两百余个候选药物正在开展临床试验.但是,国内工业界在开发临床应用级rAAV产品时面临诸多挑战,监管方对于此类产品的药学评价也缺乏实际审评经验.为此,本文总结了rAAV基因治疗产品的最新研究进展,从原材料、生产工艺及质量控制等方面对此类产品的药学评价考虑要点展开讨论,以期促进此类产品的临床转化与应用.

摘要： 目的 探讨通过心肌点注射,重组腺相关病毒9型(recombinant adeno-associated virus serotype 9,rAAV9)介导神经生长因子(nerve growth factor,NGF)基因转染糖尿病大鼠,对心脏损伤的保护作用.方法 大鼠糖尿病模型建立后4周,心脏点注射携带NGF基因的重组腺相关病毒(rAAV9-NGF),使心肌组织过表达NGF.5周后,免疫荧光检测NGF、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)和神经纤维的分布;血流动力学参数评估心脏功能;ELISA法检测心肌组织中NGF、CGRP等蛋白表达水平.结果 rAAV9介导的外源基因NGF可稳定转染,且过表达于糖尿病大鼠的心肌组织,LVSP、HR、+dp/dtmax明显下降,LVEDP?- dp/ dtmax 明显上升,心功能改善;心肌组织中的NGF?CGRP 蛋白上调;免疫荧光结果显示,转染后可部分逆转心肌组织NGF?CGRP 和神经纤维的减少.结论 心肌点注射rAAV9-NGF 基因可有效提高糖尿病大鼠心肌NGF 的表达,促进神经纤维的生长,产生对心脏的保护作用.

摘要： 造血干细胞(Hematopoetic stem cell,HSC)的基因治疗是多种遗传性疾病和获得性疾病是最佳治疗方法.重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)被认定为目前最有应用前景的基因治疗载体,已经被应用于临床,且现研究表明:rAAV6对人HSC靶向性最强.为扩大中医药在基因治疗中的应用,探究中药干预在提高rAAV6在造血干细胞中的基因表达疗效的应用,本文以人HSC细胞的模型细胞K562为研究对象,通过药物筛选发现:在蛋白酶体抑制剂效应不佳的情况下,中药紫草中的一种萘醌类化合物——紫草素可以通过增加细胞内活性氧的途径,提高rAAV6在K562细胞中的转导效率.在此基础上,本文进一步证实:紫草素可以在体外提高rAAV6在人脐带血来源的CD34+造血干细胞中的转导效率.

摘要： 目的:研究重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)的表达与表阿霉素(Epirubicin)联合作用治疗类风湿性关节炎的作用和分子机制。rn 方法:利用MTT检测rAAV-TRAIL与表阿霉素联合作用可以使类风湿性关节炎滑膜表面的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的细胞死亡率;利用蛋白免疫印迹研究细胞凋亡信号通路蛋白的变化;建立小鼠胶原性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)模型,膝关节腔内注射rAAV-TRAIL病毒并评价其治疗作用。rn 结果:对不同亚型的AAV病毒进行了筛选，体外研究发现rAAV2/5亚型对RA病人FLS细胞的侵染率更高。化疗药物表阿霉素可显著增强rAAV215在FLS中介导的外源基因表达，在CIA小鼠中表阿霉素同样可以增强AAV TRAIL的表达，rAAV2/S-TRAIL组关节组织TRAIL表达水平为10.49±1.89pg/mg，而在rAAV2/5-TRAIL和EPB联用组TRAIL表达水平提高到61.70±23.33pg/mg。rn 结论:发现rAAV2/S-TRAIL,和亚毒性剂量的化疗药物EPB联合应用可以大大提高rAAV2/5-TRAIL对类风湿关节炎的治疗作用，为重组AAV-TRAIL用于类风湿关节炎的基因治疗提供了新的资料。

摘要： 目的：基于腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)开发的基因治疗载体重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体，被认为是最有前景的基因治疗载体之一，文章旨在研究优化重组腺相关病毒(rAAV，腺相关病毒AAV)在人肝星状细胞LX-2中基因表达.rn 方法：转染miRNA24h后添加带有报告基因(Gluc)的rAAV,添加病毒48h后检测报告基因表达;以报告基因/细胞活力(Gluc/MTT)为修正的报告基因表达量,筛选60种miRNA再次进行筛选,并更换不同报告基因进行验证;最终确定11种能够促进rAAV表达的明星miRNA.rn 结果：文库中大部分miRNA能够对rAAV2-Gluc的表达起到的促进作用.rn 结论:初筛得到的60种miRNA能够促进不同报告基因的rAAV表达,证明这种提高作用不是由于报告基因引起的,在一定程度上证实了所选miRNA的正确性.

摘要： 本发明涉及能够提高重组修饰腺相关病毒(rAAV)的包装效率的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体及其在提高这种rAAV的包装效率的用途。特别地，本发明涉及重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其被进一步修饰为使用与不同血清型的rAAV的Rep蛋白相关的AAV P5和/或P40启动子替换(或增加)与通过这种rAAV编码的Rep蛋白天然相关的P5和/或P40启动子序列。使用这种替换或另外的启动子序列造成重组修饰腺相关病毒的生产增加。

摘要： 提供一种纯化病毒载体之方法。该方法包括将非离子密度梯度装载至连续流离心机转子中；采用足以从非离子密度梯度的材料中分离病毒载体及可预测污染物之方式旋转该连续流离心机转子；以及自该连续流离心机转子卸载分离之病毒载体及可预测污染物。

摘要： 本发明公开了增加腺相关病毒靶向转导效率的重组腺相关病毒及其应用。所述重组腺相关病毒含有经过改造的腺相关病毒VP2蛋白以及腺相关病毒原始的VP1蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白；其中，所述经过改造的腺相关病毒VP2蛋白是VP2衣壳蛋白的N末端插入一段FLAG标签序列。本发明进一步公开了所述重组腺相关病毒的构建方法及其在基因治疗和制备组织工程支架材料中的应用。本发明所构建的重组腺相关病毒含有FLAG表位，可有效感染靶向细胞并增强转导效率。本发明重组腺相关病毒比现有的病毒载体具有更高的转导效率与靶向性，能够应用于基因治疗、建立病毒投递系统及制备组织工程支架材料等方面。

摘要： 本发明公开了一种重组腺相关病毒的制备方法和重组杆状病毒。所述方法具体为：(1)将构建有重组腺相关病毒ITR核心表达元件和Cap基因或Rep基因的重组型杆状病毒感染相应的宿主包装细胞系；(2)将步骤(1)中感染了重组杆状病毒的宿主包装细胞系扩大培养，使产生重组腺相关病毒；(3)将步骤(2)中获得的重组腺相关病毒分离并纯化。所述重组杆状病毒为其基因组上构建有腺相关病毒ITR核心表达元件和相应血清型的Cap基因，或其基因组上构建有腺相关病毒ITR核心表达元件和Rep基因。本发明使得利用杆状病毒系统制备重组腺相关病毒的方法灵活性和通用性大大增强。

摘要： 本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及含有变异猪伪狂犬病毒的gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体、重组腺相关病毒、其制备和应用。本发明制备的以重组腺相关病毒(rAAV)为载体，表达猪伪狂犬病毒gD蛋白，rAAV具有安全性、有效性、特异性等多种优势。本发明制备的基因工程毒株表达流行变异猪伪狂犬病毒毒株的gD免疫原性蛋白，对多株流行变异猪伪狂犬病毒毒株具有良好的免疫保护性。对小鼠使用右下肢胫前肌内一次注射，就可以持续高水平诱导机体产生特异性的中和抗体和细胞免疫。

摘要： 本发明公开了一种重组腺相关病毒包装质粒、重组腺相关病毒及其应用。所述重组腺相关病毒包装质粒包括2型腺相关病毒的Rep基因和11型腺相关病毒的Cap基因。所述重组腺相关病毒，由所述的重组腺相关病毒包装质粒、腺相关病毒核心质粒和腺病毒元件辅助质粒共转染包装细胞系获得。本发明制备的重组腺相关病毒具备标记特定脑区及其上游连接网络的特性，且逆行标记效率更高。本发明解决了现有逆行标记方法效率低的难题，为神经科学研究、疾病模型建立和基因治疗等提供了更好的工具和技术支撑，具有广泛的应用价值和市场前景。

摘要： 本发明属于生物技术领域，涉及一种重组腺相关病毒载体、重组腺相关病毒及其应用。该重组腺相关病毒载体为将PD‑1细胞外段核苷酸序列插入腺相关病毒载体而形成的载体；所述PD‑1细胞外段核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的重组腺相关病毒载体，将PD1的胞外段(共170个氨基酸)插入至腺相关病毒AAV8表达后分泌出可溶性PD1，这样就能够通过可溶性PD1与肿瘤细胞上的PDL1结合，有效阻断PD‑1/PD‑L1信号通路，以阻止肿瘤细胞上的PDL1与T细胞上PD1结合而避免T细胞耗竭，改善宿主的T细胞功能，提高免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，并且对正常的细胞、组织和器官几乎无损伤，具有极高的安全性和可靠性。

摘要： 提供了以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法。还提供了将rAAV载体浓缩至高浓度的方法，例如，高达5E+13(5×1013)个载体基因组/毫升(Vg/ml)，几乎没有任何rAAV聚集体。

摘要： 本发明公开了增加腺相关病毒靶向转导效率的重组腺相关病毒及其应用。所述重组腺相关病毒含有经过改造的腺相关病毒VP2蛋白以及腺相关病毒原始的VP1蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白；其中，所述经过改造的腺相关病毒VP2蛋白是VP2衣壳蛋白的N末端插入一段FLAG标签序列。本发明进一步公开了所述重组腺相关病毒的构建方法及其在基因治疗和制备组织工程支架材料中的应用。本发明所构建的重组腺相关病毒含有FLAG表位，可有效感染靶向细胞并增强转导效率。本发明重组腺相关病毒比现有的病毒载体具有更高的转导效率与靶向性，能够应用于基因治疗、建立病毒投递系统及制备组织工程支架材料等方面。

摘要： 本发明公开了一种重组腺相关病毒的制备方法和重组杆状病毒。所述方法具体为：(1)将构建有重组腺相关病毒ITR核心表达元件和Cap基因或Rep基因的重组型杆状病毒感染相应的宿主包装细胞系；(2)将步骤(1)中感染了重组杆状病毒的宿主包装细胞系扩大培养，使产生重组腺相关病毒；(3)将步骤(2)中获得的重组腺相关病毒分离并纯化。所述重组杆状病毒为其基因组上构建有腺相关病毒ITR核心表达元件和相应血清型的Cap基因，或其基因组上构建有腺相关病毒ITR核心表达元件和Rep基因。本发明使得利用杆状病毒系统制备重组腺相关病毒的方法灵活性和通用性大大增强。