利用PCR介导的基因置换技术构建阿维链霉菌bkdF-突变株

摘要

PCR介导的基因置换技术是一种利用λ噬菌体Red重组系统在微生物中进行基因中断的新方法.实验利用该方法快速构建基因中断载体,并成功地置换了阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)bkdF基因.先合成1对长度分别为58和59nt的引物,其5'端的39nt序列分别与bkdF基因两侧同源,3'端则分别与安普霉素抗性标记盒(aac(3)Ⅳ+oriT)两侧序列一致.以该引物扩增的PCR产物电转化能表达λRed重组酶且含有目标质粒的大肠杆菌(Escherichia.coli)菌株BW25113/pIJ790/pXW1224,获得了阳性重组质粒pXW1230.将该质粒中的大小为4.0kbBg1Ⅱ目的片段插入基因置换载体pHZ1351,再接合转移至阿维链霉菌BJBM9903,筛选得到表型为ApraRThios的接合子.PCR验证并对发酵产物进行HPLC和MS分析,证实该接合子为6kdF-突变株.