番鸭HSP70的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

摘要

旨在建立一种高灵敏度的番鸭热休克蛋白70(Heat shock 70,HSP 70)基因的荧光定量PCR检测技术,并以此技术检测番鸭在热应激前后HSP70基因转录表达量的变化情况。由NCBI上HSP 70基因保守序列来设计特异性引物,将试验番鸭的mRNA反转为cDNA,检验其重复性、特异性和灵敏度,利用建立的方法对热应激条件下番鸭体内各组织基因的转录变化进行检测。结果表明:本研究构建的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法所用的引物特异性较好,与1.35×10^(2)~1.35×10^(7)copies/μL的PCR产物之间存在着良好线性关系,方程为y=-1.96 x+18.2,相关系数为-0.983,扩增效率为226.55%;熔解温度Tm值为(84.0±1.0)℃,曲线呈特异性单一峰;该方法的灵敏度为1.35×10^(2)copies/μL。与正常条件相比,热应激条件下番鸭血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的HSP 70基因表达水平显著升高(P<0.05)。该研究成功构建了番鸭HSP 70基因荧光定量PCR检测新技术,并对长期热应激条件下,番鸭体内HSP 70基因的转录水平进行了深入研究,为后续试验的开展提供了重要的数据基础和技术条件。