脂肪组织来源干细胞的成骨诱导和外源性基因转染表达研究

摘要

目的:探讨脂肪组织来源的干细胞(ADSCs)表达外源性基因的可能性。方法:取小香猪腹部皮下脂肪组织,通过I型胶原酶消化、离心等方法分离培养ADSCs,再经原代培养和传代培养。利用成骨诱导剂(10-7mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/L左旋抗坏血酸)诱导ADSCs向成骨方向分化,观察其生长形态,并通过Gomori改良钙钴法和von Kossa染色对其成骨表型进行鉴定。另设一对照组,培养基中不加入成骨诱导剂。脂质体介导人内皮细胞生长因子(hVEGF)和骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)转染ADSCs细胞,观察转染后细胞形态和生长情况,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法分别检测hVEGF mRNA、BMP-2 mRNA及其蛋白质表达。结果:成骨诱导剂能显著诱导体外培养的ADSCs向成骨细胞分化,诱导19d的ADSCs体积增大,细胞由梭形变为多边形,Gomori改良钙钴法染色显示其胞浆内富含碱性磷酸酶颗粒,诱导15d和19d,碱性磷酸酶阳性细胞分别为(25.0±7.5)%和(49.7±6.9)%。von Kossa染色表明聚集的细胞团中央有钙化结节形成。RT-PCR检测证实,经质粒转染的ADSCs中hVEGF和hBMP-2基因表达明显增强,对照组呈弱表达。免疫组织化学检测证实转染ADSCs内有棕色的阳性颗粒出现,未转染细胞则呈现阴性。结论:ADSCs能被成功诱导为成骨细胞,hVEGF和hBMP-2基因能成功地转入ADSCs并表达,这为促进骨组织工程的血管化和成骨活性奠定了基础。