VEGF基因转染脂肪组织来源干细胞提高游离脂肪移植存活率的研究

摘要

背景: 自体脂肪组织作为理想的软组织填充材料，因其生物相容性优于人工组织代用品、异体及异种材料，且无免疫排斥现象，从而得到了广泛应用。自Neuber于1893年率先应用多个自体游离的小脂肪块填充软组织缺损以来至今已达一百多年，然而移植脂肪组织颗粒的高吸收率和低存活率的问题一直在困扰着整形外科学者。 组织学研究发现，自体脂肪移植后的再血管化最早发生于手术后48小时，早期的营养供应主要依赖供体周围组织液的血浆营养，但这种营养供应是有限的，再血管化不及时或不充分将极大的影响脂肪细胞的存活，导致其变性、坏死、形成囊腔并逐渐吸收。因此，及时、充分的再血管化可能是有效提高脂肪移植存活率的关键。 血管生物学研究表明，一些细胞因子在改善缺血组织存活率方面扮演了重要的角色，其中之一就是血管内皮细胞生长因子（VEGF）。关于外源性VEGF促进皮瓣等缺血组织新生血管的形成已有相关报导。然而，外源性细胞因子所能够发挥的疗效极大地受制于移植物中血管内皮细胞的数目。因此，另一种研究的思路就是设法增加移植物中内皮细胞的数量。2001年ZUK和ZHU首次从人抽脂术获得的脂肪组织中分离得到具有多向分化潜能的干细胞，称为脂肪组织来源的干细胞（ASCs），引起广大学者的关注。抽脂术分离ASCs具有获取途径简单、获得率高，对病人创伤小等优点。研究表明，ASCs具有分泌细胞因子促进血管形成，并具有向脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、神经元细胞、血管内皮祖细胞等方向分化的潜能。但这些仅是在体外特定的定向诱导条件下ASCs表达了不同系细胞的特征，体内组织细胞的生长受到神经、体液和周围环境等诸多因素的影响，ASCs在体内环境下是否具备向不同系分化的能力尚未明了。 就目前的研究而言，不论是国内或是国外文献，尚未见将血管内皮细胞生长因子（VEGF）与脂肪干细胞联合治疗提高游离脂肪移植存活率的报导。 目的: 探索ASCs在体内是否能促进游离移植脂肪组织血运的重建，从而提高脂肪组织的存活率，研究ASCs辅助移植做为一种细胞疗法的可行性。同时还研究了VEGF基因转染ASCs联合治疗能否进一步增强这种疗效。 方法: 1．脂肪组织来源干细胞的分离培养及鉴定 取人吸脂术抽吸物的脂质部分，使用酶消化法进行原代细胞培养及传代培养，观察细胞形态及功能变化，以第三代ASCs行成脂、成骨、成软骨分化鉴定。 2．DiⅠ标记人脂肪干细胞 红色荧光染料DiⅠ体外标记ASCs，倒置显微镜及荧光显微镜观察细胞生长情况。 3．Ad-VEGF165体外转染ASCs及转染后目的基因表达 前期实验发现腺病毒转染ASCs时，感染复数（MOI）值为50时较理想，转染率可达到90%以上，故按50进行转染。通过免疫细胞荧光检测VEGF在细胞内的表达情况，同时利用ELISA测定细胞培养上清液中VEGF浓度水平。 4．脂肪移植模型制备及分组 将A、B、C、D四组移植物随机注入每只裸鼠背部皮下：A组为转染了VEGF的ASCs与脂肪组织混合物；B组为未转染VEGF的ASCs与脂肪；C组为胰岛素与脂肪混合物；D组为培养基与脂肪混合做为空白对照。 5．脂肪移植术后观察 术后6个月对游离移植脂肪组织进行观察，指标有：（1）各组脂肪组织湿重测定；（2）纤维化及坏死程度的测定；（3）移植物中毛细血管数目；（4）移植物中毛细血管内皮细胞的起源。 6．统计学处理 数据以均数±标准差（x±s）表示，使用统计软件SPSS13．0进行数据处理。采用重复测量方差分析，均数两两之间的比较采用LSD检验。 结果; 1．分离培养的ASCs形态类似于成纤维细胞，具有很强的增殖及多向分化能力。在成脂、成骨及成软骨分化诱导培养基的作用下，分化出成熟的脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，油红O、茜素红染色和阿利新蓝染色阳性。 2．DiⅠ标记后荧光显微镜下观察，见全部脂肪干细胞标记后均显红色荧光，标记的脂肪干细胞呈梭形，胞浆丰富，保持了良好的正常形态，DiⅠ标记阳性率为100%，细胞核未染荧光。该荧光染料不破坏细胞，不干扰细胞增殖，染色效果好，是脂肪干细胞示踪的好方法。 3．VEGF转染ASCs72小时后，超过90%ASCs免疫荧光染色显阳性，未转染的ASCs仅有少许荧光染色显阳性。转染组上清液中VEGF的分泌水平明显高于非转染对照组（P<0．01）。 4．（1）6个月后各组移植脂肪湿重分别为：VEGF基因转染ASCs组（190．91±29．51mg），ASCs组（165．90±32．47mg），胰岛素组（98．45±13．36mg），培养基对照组（71．69±15．59mg），各组之间两两比较有统计学差异。（2）组织学切片观察结果：C、D组移植物中大部分脂肪坏死，大量纤维组织增生。A、B组存活的脂肪结构保持较完整，纤维增生明显少于对照组。（3）毛细血管计数结果：四组移植物的血管密度计数分别为A组（42．17±5．80）个/20HP，B组（16．89±6．15）个/20HP，C组（6．67±2．99）个/20HP，D组（2．28±0．75）个/20HP。A组毛细血管数目显著多于其余三组，B组也有较多的毛细血管，C、D组仅有少许血管分布其中。（4）移植物中毛细血管内皮细胞的起源：DiⅠ标记的发出红色荧光的ASCs存在于A、B组移植物的部分血管中，并散在分布于部分脂肪细胞中。小鼠抗人CD31及山羊抗小鼠IgG-FITC标记显示出绿色荧光的血管环。图像叠加证实，ASCs在体内能够部分转化为血管内皮细胞及脂肪细胞。B、C组荧光显微镜观察未见血管环，仅有一些本底荧光。 讨论: 目前，游离脂肪移植仍存在高吸收率和低存活率的问题。游离的脂肪组织移植到受区以后，其血液供应是成活的基础。早期的营养供应主要依赖供体周围组织液的血浆营养，但这种营养供应是有限的，不能保证供体的长期存活，仅能帮助其渡过早期的缺血缺氧状态。移植48小时后，供体组织开始与受区血管床建立新的血液循环，此再血管化过程是游离移植能否成功的决定因素，再血管化不及时或不充分都会导致供体组织发生坏死。因此探索促进游离移植脂肪组织再血管化的手段，是整形外科技术发展的迫切需要。 细胞疗法可能是解决脂肪移植后早期再血管化问题的一种有效办法。 细胞疗法是指应用自体、异体或同种异体的细胞，经体外操作后回输（或植入）人体，以达到治疗、诊断或预防作用的目的。细胞疗法最初和最成功的范例是输血和骨髓、造血干细胞移植。近年来，随着人们对于细胞研究的不断深入，细胞疗法的治疗领域不断拓宽，延伸到了肿瘤的生物治疗、免疫治疗，糖尿病、冠心病、促进血管生成和创面愈合等领域。研究表明，ASCs具有分泌细胞因子促进血管形成，并具有向脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、内皮细胞等方向分化的潜能。ASCs与其它的干细胞相比有显著的优越性：①ASCs容易获得，对患者造成的痛苦小。②ASCs在体外增殖速度快，不必进行永生化处理就能获得足够量的细胞用于移植。③ASCs能够进行自体移植，无免疫排斥的反应。 本实验通过从人抽脂术获得的脂肪组织中分离得到的ASCs，与取自人体的脂肪混合移植于裸鼠。实验结果表明：裸鼠背部移植的脂肪组织术后6个月ASCs组移植脂肪组织存活率高于胰岛素组及对照组。ASCs组存活的脂肪组织质地较软，脂肪结构保持较完整，脂肪小叶及小叶间隔保持较好，脂肪纤维化及坏死程度低于胰岛素组及对照组。荧光示踪证实ASCs存在于移植脂肪的部分脂肪细胞及小叶间隔中，在体内能够部分转化为血管内皮细胞及脂肪细胞，促进了游离移植脂肪组织的再血管化。 血管生物学研究表明，一些细胞因子在改善缺血组织存活率方面扮演了重要的角色，VEGF作用于血管形成的早期，可以促进血管内皮细胞增生，并改善血管的通透性。VEGF应用方式一般可分为直接应用和间接应用。直接应用VEGF有其局限性：①VEGF价格昂贵；②难以在体内保持持续的有效浓度；⑨不能自我调节。间接应用是利用基因转染技术将基因整合进宿主细胞，将一些能产生VEGF的细胞种植在局部组织，使其在较长时间内持续、稳定地产生VEGF，能很好地克服直接应用的缺陷。本实验即采用这种间接应用的方法，使用ASCs作为载体持续释放内源性的VEGF。实验结果表明，VEGF基因转染ASCs组能有效提高脂肪移植存活率，增加移植物中毛细血管的密度，其疗效优于未转染的ASCs组。已有很多研究证实VEGF能有力的促进移植物的再血管化，但以ASCs作为载体释放内源性的VEGF以提高游离脂肪移植存活率国内外未见文献报导。 结论: ASCs在体内能够分化为血管内皮细胞及脂肪细胞并促进了游离移植脂肪组织的血运重建，减轻了脂肪组织的纤维化，改善了存活脂肪的质地，提高了移植脂肪的存活率。ASCs辅助移植是一种有效的细胞疗法。联合VEGF基因转染能进一步强化这种疗效。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

前 言

第一章 成人脂肪来源干细胞的分离培养及鉴定

1.1 引言

1.2材料与方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5结论

第一章附图

第二章 脂肪干细胞DiI标记及Ad-VEGF165转染

2.1 引言

2.2材料与方法

2.3 结果

2.4讨论

2.5 结论

第二章附图

第三章脂肪移植模型制备及植入后实验研究

3.1 引言

3.2材料方法

3.3 结果

3.4讨论

3.5 结论

第三章附图

全文小结

参考文献

综述：脂肪组织工程及其血管新生

攻读学位期间的成果

致 谢