Akt/mTOR信号通路介导低浓度过氧化氢对小鼠表皮干细胞的促增殖作用

摘要

目的:探讨低浓度过氧化氢(H_2O_2)对小鼠表皮干细胞(mESCs)体外促增殖作用及其机制。方法:以酶消化法分离培养mESCs。免疫荧光技术鉴定第3代mESCsβ1整合素和角蛋白19(K19)表达,流式细胞术鉴定CD34的表达;以不同低浓度H_2O_2(0、25、50、100、150和200μmol/L)处理mESCs 48 h和72h。同时,另一组实验中在用不同浓度H_2O_2刺激的同时加入或不加入雷帕霉素(50 ng/ml)培养48 h。甲氮甲唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;Western Blot法检测H_2O_2刺激小鼠mESCs 48 h Akt/mTOR信号通路关键蛋白mTOR、Akt、P70s6k、e IF4E、4E-BP1、p-mTOR、p-Akt、p-P70s6k、p-eIF4E、p-4E-BP1和细胞增殖相关蛋白Cyclin D1、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果:免疫荧光技术检测分离培养的mESCs细胞100%表达β1整合素和K19;流式细胞术检测99.8%的mESCs表达CD34;MTT检测结果显示,48 h和72 h时25μmol/L和50μmol/L的H_2O_2可以有效地促进mESCs的增殖(P<0.05),而雷帕霉素能拮抗这一效应;但当H_2O_2浓度为200μmol/L时,则显著抑制mESCs增殖(P<0.05);免疫印迹结果显示低浓度H_2O_2处理mESCs 48 h后,Akt/mTOR信号通路关键蛋白mTOR、Akt、eIF4E、4E-BP1水平及其磷酸化水平(p-mTOR、p-eIF4E、p-4E-BP1)显著增加(P<0.05或P<0.01),当H_2O_2浓度为200μmol/L时则抑制其表达(P<0.05或P<0.01)。此外,50μmol/L的H_2O_2能上调细胞周期蛋白Cyclin D1和PCNA的表达,而雷帕霉素能拮抗这一作用。结论:低浓度的H_2O_2对mESCs有明显的促增殖作用,并且能激活Akt/mTOR通路。而低浓度H_2O_2对mESCs的促增殖作用至少部分是通过活化Akt/mTOR信号通路介导的。