Cas9蛋白变体VQR高效识别水稻NGAC前间区序列邻近基序

摘要

成簇的规律间隔短回文重复序列及CRISPR相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9)系统是近年来发展起来并被广泛应用的第三代基因组编辑工具.但是,该系统的酿脓链球菌Cas9(Streptococcus pyogenes,SpCas9)仅能识别NGG前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM),极大地限制了基因组编辑的范围.SpCas9变体VQR(D1135V/R1335Q/T1337R)在水稻中可识别NGAA、NGAG和NGAT PAM,但尚不清楚是否能识别NGAC PAM.本研究利用改进后的CRISPR/VQR系统对水稻中3个相对低效的VQR靶位点NAL1-Q1、NAL1-Q2和LPA1-Q进行了编辑,结果表明改进后的CRISPR/VQR系统可以高效编辑这3个靶位点,编辑效率分别为9.75％、43.90％和29.26％.为了明确改进后的CRISPR/VQR系统对NGAC PAM的识别情况,本研究选择水稻叶片宽度调控基因NARROW LEAF 1(NAL1)中的NAL-C位点和蜡质合成基因GLOSSY1(GL1)中的GL1-C位点进行基因编辑,并获得57株转基因水稻.靶位点PCR扩增及测序结果表明,NAL1-C和GL1-C靶标位点突变的植株分别为27株和44株,突变率分别为47.36％和77.19％;其中NAL1-C/GL1-C双突变植株为26株,双突变率为45.61％.进一步分析表明,CRISPR/VQR系统造成的突变有4种类型,分别为杂合突变、双等位突变、嵌合体突变和纯合突变,其中以杂合突变和双等位突变为主.这些结果表明,改进的CRISPR/VQR系统可以高效编辑水稻NGAC PAM位点,并产生丰富的突变类型.本研究为水稻及其他植物相关基因NGAC PAM位点的编辑提供了理论依据.