基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析平台的构建、优化及其应用

摘要

文章建立并优化了一种基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR技术,该技术采用了嵌合特异引物引导荧光通用引物的扩增方案,多个目的基因被一对通用引物等比例扩增,从而实现多重定量检测.该技术实现了经济可靠的中通量基因表达定量研究,弥补了基因表达分析平台中cDNA芯片定量准确性低和Real-time quanti-tative PCR通量小的缺点,完善了整个基因表达的分析过程.文章以小鼠X染色体上影响性发育启动的QTL区段为例,选择11个目的基因进行了技术构建及优化,确定了该技术的检测灵敏度为102拷贝,通用引物与上游嵌合特异引物的比例以1:1为佳,并且验证了该技术的重复性和准确性.降落(Touchdown)PCR结合通用引物补加实验表明,该优化步骤可大大改善低丰度表达基因的扩增.通过对2个品系(C3H/HeJ和C57BL/6J)15日龄小鼠的下丘脑和睾丸组织中的11个基因的表达分析,在下丘脑中找到了一个差异表达的基因PHF6可用于进一步的基因功能研究.