高内涵筛选技术联合多能性基因Oct4、Sox2和Nanog检测建立药物胚胎毒性快速筛查方法

摘要

目的通过高内涵筛选技术评价测试药对PA-1细胞的增殖毒性,并联合分化毒性的评价指标——多能性基因(Oct4、Sox2和Nanog)表达检测,初步建立药物胚胎毒性快速筛查方法。方法选择维生素C、青霉素G、维生素E作为无胚胎毒性的阴性测试药,甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺作为具有胚胎毒性的阳性测试药。以测试药临床治疗剂量下的最大血药浓度(C_(max))为基础设置加药浓度,阴性测试药设置浓度梯度为:1/2C_(max)、C_(max)、2C_(max)、3C_(max)、4C_(max);阳性测试药设置浓度梯度为:1/8C_(max)、1/4C_(max)、1/2C_(max)、C_(max)、2C_(max)。测试药物在维持培养液(培养液加入1×10^(6) U·L^(-1)的白血病抑制因子)中作用于PA-1细胞24 h后,基于高内涵筛选技术,应用DAPI、Calcein-AM、PI共染PA-1细胞,通过共聚焦成像检测荧光强度,计算细胞存活率;测试药物在分化培养液(不加入白血病抑制因子)中作用于PA-1细胞24 h后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表达变化。结果DAPI、Calcein-AM、PI 3者共染可以很好地区分活细胞及死细胞;阴性测试药维生素C、维生素E、青霉素G对PA-1细胞的增殖能力均无影响;与对照组比较,阳性测试药5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤1/4C_(max)及以上浓度引起PA-1细胞存活率显著下降(P<0.05);环磷酰胺1/8C_(max)及以上浓度引起PA-1细胞存活率显著下降(P<0.05)。阴性测试药维生素C、维生素E、青霉素G对PA-1细胞多能性基因Sox2、Oct4、Nanog的表达均无影响。与对照组比较,阳性测试药5-氟尿嘧啶1/8C_(max)及以上浓度使PA-1细胞多能性基因Sox2、Oct4、Nanog的表达显著下降(P<0.05);甲氨蝶呤1/8C_(max)及以上浓度使Oct4、Nanog的表达显著增加(P<0.05),但当浓度达到2C_(max)时对Sox2的表达依然没有影响;环磷酰胺1/8C_(max)及以上浓度使Sox2、Oct4、Nanog的表达均显著增加(P<0.05)。结论高内涵筛选技术(DAPI、Calcein-AM、PI共染)联合多能性基因的检测可初步建立药物胚胎毒性快速筛查方法。