发展中的mRNA差别显示技术

摘要

随着ＰＣＲ技术的出现（１９８５），在分子生物学界又相继出现了两个很有影响的新技术──ＲＡＰＤ技术（１９９０）和ｍＲＮＡ差示法（１９９２），前者用于分子标记，后者用于基因分离。ｍＲＮＡ差示法的生物学基础是基因的差别表达，既：单个细胞中表达的基因仅占基因总数的１５％。这种基因的差别表达决定了生命的所有过程，如：发育和分化、对逆境的反应、细胞分裂、老化等，图一给出了该方法最初的技术路线。提取要比较的两种或两种以上样品的ｍＲＮＡｓ，分别逆转录成ｃＤＮＡｓ，经过ＰＣＲ扩增后，直接进行测序胶电泳即可识别有差别的ｍＲＮＡ。其中、关键的是ＰＣＲ扩增时两个引物的设计．３＇端引物Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ＭＮ很容易与具有Ｎ＇Ｍ＇－ｐｏｌｙ（Ａ）－３＇末端的大多数ｍＲＮＡ结合，进行ｃＤＮＡ的逆转录合成。Ｍ、Ｎ提供锚定位点，防止３＇端引物在ｐｏｌｙ（Ａ）序列不同位置上的随机结合。５＇端为１０个碱基的随机引物。这个经验上的碱基数值较理论的６－７个碱基（表一）更能满足测序胶电泳要求的条件：分子大小在５００ｂｐ左右，每条泳道上条带数在１００条左右。该方法近年来又有如下改进：一、ＰＣＲ退火温度由４２℃改为４０℃，可在保证特异性的同时，增加泳道上的?