牛星状病毒ORF2基因遗传进化分析及原核表达

摘要

为了解牛星状病毒(bovine astrovirus,BoAstV)ORF2基因的遗传进化并获得原核表达的衣壳蛋白,从牛腹泻粪便中提取总RNA,扩增BoAstV ORF2基因,将ORF2基因克隆至pMD19-T载体中并测序,利用生物信息学软件分析基因的遗传进化。将位于BoAstV衣壳蛋白高度保守区的ORF2-1200基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET28a-ORF2-1200。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达并优化诱导条件,经过超声破碎离心并鉴定蛋白可溶性,最后利用亲和层析镍柱对重组蛋白进行纯化和Western blot鉴定。结果表明:ORF2基因全长2304 bp,编码768 aa,ORF2基因属MAstV-28基因型,与日本毒株Ishikawa24-6亲缘关系最近,与20个参考毒株的ORF2基因氨基酸同源性为53.2%~86.0%。试验成功构建了重组载体,经条件优化,在37℃,1.0 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6 h情况下蛋白表达量最高,目的蛋白大小55 kDa左右,目的蛋白以包涵体形式存在,Western blot检测目的蛋白正确表达。本试验通过分析BoAstV ORF2基因的遗传进化情况,明确MAstV-28型BoAstV在中国的流行;对ORF2基因保守区域进行克隆和原核表达及纯化,成功获得了重组蛋白,为深入研究蛋白功能和建立BoAstV血清学检测方法奠定了基础。