棉铃虫效应蛋白HARP1体外表达与纯化体系的建立

摘要

[目的]本文旨在通过建立棉铃虫效应蛋白HARP1体外表达纯化体系,对HARP1蛋白进行体外表达和纯化,为解析HARP1蛋白与植物茉莉酸信号途径中JAZ蛋白的互作分子机制奠定基础。[方法]对harp1基因序列进行密码子优化,使用蛋白预测软件预测HARP1中的信号肽和成熟肽。基于以上信息构建目的蛋白的表达质粒并进行诱导表达,使用亲和层析、酶切、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对目的蛋白进行纯化,使用SDS-PAGE和Western blot对蛋白进行分析和检测。[结果]通过优化将harp1基因密码子适应度值(CAI)从0.39提升到0.95。蛋白预测软件预测N末端21个氨基酸为信号肽,信号肽与成熟肽切割位点在第21位丙氨酸和第22位亮氨酸之间,成熟肽为第22位亮氨酸至第122位精氨酸。构建表达质粒pETDuet1-His6-MBP-3C-HARP1(22~122),IPTG能够诱导目的蛋白表达,使用Ni-NTA柱纯化出融合蛋白His6-MBP-3C-HARP1(22~122),3C蛋白酶能够切除His6-MBP标签,使用阴离子交换柱成功分离His6-MBP标签和HARP1(22~122)蛋白,使用Superdex 200 increase Gel Filtration Column进一步纯化获得单体HARP1(22~122)蛋白。[结论]成功建立HARP1蛋白体外表达与纯化体系。