酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性的研究

摘要

目的研究酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性,及其增效机制。方法恶性疟原虫氯喹抗性株(FccSM1/yN株)取自云南省思茅地区恶性疟患者静脉血,经同步化处理,用新鲜血将红细胞感染率调至0.5%～1.0%,红细胞压积与培养基体积比(红细胞比容)为1∶9,混匀。制备氯喹药板及氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)组合药板。氯喹药板自上而下每行氯喹终浓度依次为0.3125～2560nmol/L,呈2倍递增。氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)组合药板,是在氯喹药板基础上加入酮替芬(或赛庚啶),每行10孔自左至右终浓度依次为9.77～5000nmol/L,呈2倍递增,每块药板均设A行空白对照。每孔加混匀血样50μl,37℃培养34h,镜检计数每200个疟原虫中含3个核以上裂殖体数,计算氯喹单药及各配伍组对恶性疟原虫的半数抑制浓度(IC50),以及酮替芬(或赛庚啶)提高氯喹活性的指数(AEI)。选择AEI值较高的配伍组,进行增效时序性研究。当氯喹对虫体作用0～10h分别加入酮替芬(或赛庚啶),34h后检测和计算各时间段IC50及AEI。选择氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)最佳配伍剂量,培养恶性疟原虫20h,提取总RNA,用实时荧光定量PCR(real-timePCR)分析药物作用前后恶性疟原虫氯喹抗性转移基因(pfcrt)和多药抗性基因(pfmdr1)表达水平。结果0.3125～2560nmol/L氯喹与625nmol/L酮替芬(或赛庚啶)配伍,增效作用显著,氯喹/酮替芬的IC50为74.53nmol/L,AEI为0.42;氯喹/赛庚啶的IC50为89.70nmol/L、AEI为0.30。5nmol/L氯喹作用6～7h加入625nmol/L酮替芬(或赛庚啶),增效作用显著,氯喹/酮替芬的IC50为67.70nmol/L、AEI为0.47;氯喹/赛庚啶的IC50为81.53nmol/L、AEI为0.37。5nmol/L氯喹与625nmol/L酮替芬(或赛庚啶)配伍,作用20h,氯喹/酮替芬可使pfcrt基因表达水平升高91%,而氯喹/赛庚啶可使pfmdr1基因表达水平下降14%。结论体外氯喹与适量的酮替芬(或赛庚啶)配伍,能增强恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹的反应性。氯喹对虫体作用6～7h加入酮替芬(或赛庚啶)增效作用显著。该增效作用与pfcrt基因和pfmdr1基因的表达水平有关。