FGFR2条件性敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定

摘要

目的　构建成纤维细胞生长因子2型受体(Fibroblastgrowthfactorreceptor 2,FGFR2)条件性敲除载体,并对中 靶ES细胞进行筛选与鉴定,为最终建立FGFR2条件性敲除小鼠模型,研究FGFR2在小鼠骨骼、肺脏等组织、器官发育过程 中的作用打下基础。方法　在分析小鼠FGFR2基因组DNA序列结构的基础上,设计并构建了条件性敲除小鼠FGFR2外 显子7、8的基因打靶载体,采用电穿孔法在ES细胞中进行了打靶重组,G418与Ganciclovir被用于对电转的ES细胞进行正 负筛选,最后对ES细胞克隆进行了Southern与PCR鉴定。结果　将所构建的条件性打靶载体通过电穿孔转染入表达重组 酶(Cre)的AmI细菌,经PCR、酶切和测序鉴定,Cre酶能正确将条件性打靶载体的外显子7、8和选择性标记Neo基因经重 组剔除,电转了基因敲除载体的ES细胞经正负筛选后共挑取克隆83个;经5′端探针Southern杂交鉴定,发现4株阳性克 隆;该4株克隆再经3′端探针Southern杂交鉴定,发现2株阳性克隆;最后经Southern和PCR检测发现1株ES细胞克隆仍 保留外显子7、8两侧的loxP序列。结论　FGFR2条件性基因敲除ES细胞已成功构建。