小立碗藓C3H基因敲除载体的构建及C3H1-nptⅡ-C3H2目的片段最佳PCR条件筛选

摘要

以小立碗藓作为试材,将总长为1 981 bp的小立碗藓C3H基因分为上游片段(1 000 bp),下游片段(981 bp),并以此设计引物,得到上游臂(C3H1,735 bp)、下游臂(C3H2,700 bp).在C3H1引物设计时引入XhoI、EcoRV酶切位点到两端,C3H2设计时引入NdeI、BamHI酶切位点到两端.以小立碗藓总DNA为模板,通过PCR扩增得到C3H1和C3H2片段.将C3H1和C3 H2插入到pTN182载体中,获得敲除载体(C3H1-pTN182-C3H2质粒),通过PCR获得C3H1-nptⅡ-C3H2目的片段,并且采用单因素方法研究引物浓度与退火温度对PCR产物浓度及特异性的影响.结果表明:引物浓度为0.20 μmol/L,退火温度为58.7℃,PCR产物特异性最高且产物浓度较高.