目的:在人胚肾HEK293细胞中转染真核表达载体pSNA2/hEndostatin(hEndostatin,人血管抑素),建立能稳定分泌hES的基因工程细胞株.方法:将含有IL-2分泌肽的人endostatin(ES)全长cDNA插入真核表达载体pSNA2,产生重组质粒pSNA2/hEndostatin;利用阳离子脂质体介导将其转染入HEK293细胞中;用G418筛选出阳性克隆细胞,将其命名为hE/293细胞.用Western blot法检测hE/293细胞培养上清中分泌的hES蛋白.血管内皮细胞(ECV304)增殖抑制试验及鸡胚尿囊膜试验观察其分泌的hES蛋白的抗增殖活性.结果:经过双酶切和DNA测序证实构建出了含hES基因的真核表达载体.通过G418抗性筛选筛选出稳定表达hES的细胞株3株,将其命名为hE/293细胞;Western blot检测该细胞株培养上清中存在分子量为20 kDa的ES蛋白;ECV304增殖抑制试验显示,与HEK293细胞组相比,hE/293细胞组分泌的ES蛋白对bFGF刺激的血管内皮细胞增殖有明显的抑制作用(48h:0.125±0.007 vs 0.159±0.020,P<0.01;72 h:0.088±0.016 vs 0.249±0.070,P<0.01);鸡胚尿囊膜试验证实hE/293细胞分泌的ES蛋白可以抑制鸡胚尿囊膜血管生长.结论:所构建的hE/293细胞株可以稳定的分泌hES蛋白,并能抑制ECV304细胞生长及鸡胚尿囊膜血管生长.
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