半固体培养及快速筛选策略在恶性疟原虫相关单克隆抗体制备中的应用

摘要

目的以恶性疟原虫富组氨酸蛋白单克隆抗体的制备为例,分析半固体培养技术和筛选鉴定策略在单克隆抗体制备中的关键作用。方法用恶性疟原虫富组氨酸蛋白重组抗原(re Pf-HRP)免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤SP20细胞融合,于含2%甲基纤维素的半固体培养基中培养,使融合细胞呈集落化生长;将单细胞集落转移至液体培养基中培养;建立不同的抗原和ELISA检测方法对培养上清进行筛选;经粗筛和特异性筛选为阳性的细胞株置液氮保存。冻存复苏后,对稳定分泌特异性抗体的单抗细胞株进一步分析腹水产量、抗体亚类、抗体识别位点、抗体的亲和常数及配对检测抗原的灵敏度。结果细胞融合后经半固体培养获得的单克隆细胞株为915个,粗筛的克隆阳性率为37.8%(346/915);特异性筛选的克隆阳性率仅占粗筛检测阳性的2.6%(9/346),占总克隆数的0.98%(9/915),经液氮冻存复苏鉴定,获得了8株稳定分泌特异性抗体的单抗细胞株;经腹水产量、抗体亚类、抗体识别位点、抗体的亲和常数及配对检测抗原的灵敏度等检测,最终获得了2株可用于快速检测恶性疟患者血液样本中特异性循环抗原的配对抗体。结论半固体培养保证了可供筛选的融合细胞的数量,粗筛和特异性筛选结合的策略保证了快速筛选出特异性克隆。