羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究

摘要

目的:乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关。为深入研究HBV调节表达的机制,我们应用噬菌体展示技术,以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物,筛选肝细胞cDNA文库,获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN)。CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用。CPN是分子量280kD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83kD调节亚单位。核心启动子产生两个3.5kb RNA:前-核心和前基因组RNA。前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原,前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白,而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳,作为模板逆转录。前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用。核心启动子分为两部分:基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS),其上游为负性调节元件(NER,1616-1621nt)。CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚,我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体,通过脂质体转染NIH 3T3细胞,研究CPN对核心启动子的调节表达。方法:根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物,在核心启动子的引物两端引入MluⅠ和NheⅠ的酶切位点,在羧肽酶N的引物两端引入EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位点。用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因,克隆到pGEM-Teasy载体上。核心启动子经MluⅠ和NheⅠ双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上,羧肽酶N经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上,构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体,脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞。结果:HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1％琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206 bp和580 bp。重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功。脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加。通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达。结论:HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N(CPN)与HBV核心启动子共转染细胞,明显调节HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础。