对细胞培养用水解乳蛋白研制中的几个问题讨论

摘要

本文系统总结了细胞培养用水解乳蛋白研制工作的资料,并从生物化学角度对有关问题进行了初步讨论。1、鲜乳组成及从鲜乳中提取蛋白工艺的依据:根据细胞培养所需十二种氨基酸的基本要求,确认乳中三类蛋白质可满足细胞生长需要,考虑到工业化生产的要求,拟以调等电点方法从鲜乳中分离三类蛋白质。鲜乳的pH 为6.6±0.2,在加热脱脂后调pH 至4.5即可析出酪蛋白,分离后的上清液再调pH 至6.0可析出白蛋白,二次分离后的上清液再调pH 至7.0,则球蛋白析出。得率为酪蛋白2.5%、白蛋白0.6%、球蛋白0.1%。产品冻干、研磨待消化。采用等电点法分离乳蛋白操作简便,分离效果较好。2、乳蛋白酶解工艺的比较分析:考虑到酸、碱水解对氨基酸成份有破坏作用,故采用酶解法。由于乳蛋白中各类蛋白的酶解能力差异很大(酪>白>球),所以试用过胃蛋白酶、胰蛋白酶、A·S1.398枯草茅孢杆菌蛋白酶、栖土曲霉3.943蛋白酶和肽酶进行单酶、二酶、三酶水解的比较。酶量的加入采用优选法确立。同时又考虑到尽可能地充实水解物的氨基酸的质量和数量,又在酶解配方中少量掺入具有丰富营养的小牛血清、心肌等。水解采用测定水解液氨基氮含量作为指标(酪蛋白以AaN 量达400、白,球达300为终点),反应最适pH 控制在8.0,温度40—42℃。结果:酪蛋白经A·S1.398酶(活力4.1万单位/100毫升)水解,第六天AaN/N=41%,AaN 在第10小时起一直保持在300—400之间起伏,6天时才稳定于400水平而经A·S1.398酶、胰酶和肽酶等三酶混合水解速度更快,60小时左右即达AaN400水平,二酶次之。白蛋白的水解与酪蛋白水解的曲线基本相似。球蛋白水解最困难。3、对自制水解乳蛋白产品的化学分析:曾进行了自制品与德国产品(RoTH)、美国产品(DiFco)和英国产品(OxOid)的比较,发现氨基酸纸谱分析定性斑点数基本接近,但色泽、灰分和盐分含量均比国外差或高,如Nacl 含量ROTH 产品为2.7%,自制品为2.6—7.6%(七批抽样)平均5.29%;灰分ROTH 产品为8.3%自制品为4.86—14.67%,平均10.5%;AaN 含量ROTH 产品为6.83%,自制品为4.79%—7.26%,平均6.23%;含磷量德制品0.5%、美制品0.39%、英制品0.45%,自制品为0.75—0.9%(五批抽样),平均为0.88%。4、水解乳蛋白试产品的细胞生长试验:曾以自制品与德国产品进行比较,进行过初代猪肾细胞的培养,结果发现小试自制品和中试自制品培养的细胞生长良好,自制品大多数能生长成片,生长速度与对照(德制品)接近,一般3—5天内生长致密单层。