生长激素释放因子(GRF)的基因改造及化学合成

摘要

为了提高生长激素释放因子（ＧＲＦ）的体内活性，根据猪ＧＲＦ的天然序列，设计了改造后ＧＲＦ（１～３２）的基因序列（含信号肽），两端加设ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ的粘性末端，分４段由ＤＮＡ合成仪合成，每段长度分别为９５、９７、８６、１０６ＮＴ，２条链间有１５个碱基的粘端。用尿素变性ＰＡＧＥ纯化合成片段，用Ｔ４多核苷酸激酶对合成ＤＮＡ磷酸化，混合４个片段复性，然后用Ｔ４连接酶连接。提取ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ质粒，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ在Ｍｕｌｔｉｃｏｒｅｂｕｆｅｒ中酶切完全后，琼脂糖电泳，由ＧｅｎｅＥｌｕｔｅＡｇｒｏｓｅＳｐｉｎＣｏｌｕｍｓ回收酶切大片段。将该酶切片段与上述合成的ＧＲＦ基因由Ｔ４连接酶连接，并转化至氯化钙致敏的ＤＨ５α。选取重组菌落，提取质粒，用ＰＣＲ及双酶切鉴定阳性克隆。用Ｍｉｎｉｐｒｅｐ提取重组质粒，ＡＢＩ３７３自动测序仪测序。测序结果表明已克隆到合成的ＧＲＦ基因。