t-PA突变体真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的瞬时表达

摘要

根据t PAcDNA的全长序列 ,设计了扩增t PA信号肽cDNA的引物 ,并进而获得了信号肽cDNA片段。将其回收纯化后 ,作为上游引物 ,结合原有的t PA下游引物 ,分别以t PA的缺失性原核表达载体pErA ,以及后者的点突变体pErA(K)为模板 ,进行PCR反应 ,从而使二者各自增加了信号肽部分。进一步将其分别克隆至pcDNA3 0 ,构建了相应的真核表达载体pCSRA与pCSRK。酶切及测序结果均证明了构建的正确性。经LIPOFECTAMINE[TM] 2 0 0 0Reagent将其分别转染至COS 7细胞 ,并同时设以pCDNA3 0为阴性对照。取转染后不同时间培养上清 ,以FAPA法进行检测。结果表明 ,上述构建载体的表达产物具有良好的溶圈活性。本实验为t