TNF-α/放线菌素D诱导原代培养内皮细胞凋亡模型的建立

摘要

目的建立RNA合成抑制剂——放线菌素D(actinomycin D,act D)作用下,TNF-α诱导原代培养内皮细胞凋亡的模型,并探讨其作用机制。方法在原代培养3～4代以内的牛主动脉内皮细胞中,加入一定浓度TNF-α/act D作用一定时间。采用MTT细胞活性检测确定最适TNF-α/act D作用浓度和时间。通过DNA ladder分析、流式细胞仪分析、丫啶橙/溴化乙啶染色等方法检测内皮细胞凋亡,用Western blot检测Bcl-2表达、MAPK(ERK1/2)激活水平,以p-NA为底物检测caspase-3活性。结果在一定浓度增敏剂放线菌素D作用下,TNF-α呈浓度依赖性降低细胞活性,促使部分内皮细胞核浓聚、碎裂,导致DNA ladder形成。流式细胞仪分析进一步证明TNF-α/act D增加内皮细胞凋亡比例,并且使内皮细胞中caspase-3活性增加,Bcl-2的表达水平呈时间依赖性的降低以及MAPK (ERK1/2)失活。结论本研究建立了放线菌素D作用下TNF-α诱导原代培养内皮细胞凋亡的模型,并初步探讨其机制,为进一步研究动脉粥样硬化、血管生成等内皮细胞凋亡相关疾病的发病机制提供一定的实验基础。