抗C反应蛋白单域抗体噬菌体库的构建与初步鉴定

摘要

以CRP为免疫原免疫双峰驼后分离外周血淋巴细胞,提取总RNA后经逆转录制备cDNA,通过巢式PCR实验获得目的基因片段并克隆至噬菌体T7载体臂上,构建原始噬菌体库。随后进行4轮生物淘选,通过Phage-ELISA鉴定淘选后的噬菌体库,Bam HⅠ、Hin dⅢ双酶切构建了pET-28a与阳性克隆的重组质粒,转化入BL21菌株中进行低温诱导表达。经过His-镍离子亲和层析柱纯化获得单域抗体,然后再用间接ELISA鉴定单域抗体与CRP的反应性。研究结果显示,试验成功构建了库容为1.08×10^8 cfu的抗CRP单域抗体噬菌体库,基因插入率为96.43%(27/28)。生物淘选获得了4株与CRP特异性结合的阳性克隆,4株阳性克隆表达载体构建成功,并在BL21细胞中成功表达单域抗体,分子质量约为22 ku。经ELISA鉴定,4个抗体均显示出高亲和力与特异性,其中V2与V3的抗体效价高达1∶3200,证明该抗体能够适用于实际检测方法开发。