miRNA-152和miRNA-200s在IL-6诱导的肝胰岛素抵抗中的作用

摘要

目的胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要发病机制之一。microRNA（miRNA）是-簇长度约为20—24个核苷酸的单链非编码的小分子RNA。它们在转录后水平对下游靶基因进行调控。miRNA广泛表达于各种组织器官中，对组织器官的功能和发育具有重要的作用。miRNA参与糖尿病及其并发症的发生。它们调控胰岛素的合成、分泌、胰岛素信号通路和糖脂代谢等过程。目前，与肝胰岛素抵抗相关的miRNA报道尚少。研究证明miRNA．152和miRNA-200s与肿瘤的发生密切相关，但miR—NA-152和miRNA-200s是否在肝胰岛素抵抗发生中起重要作用？目前尚不清楚。本研究通过建立IL-6诱导的胰岛素抵抗的细胞和动物模型，分析细胞或肝脏组织中miRNA-152和miRNA-200s的表达变化，探讨miRNA-152和miRNA-200s在IL-6诱导的肝胰岛素抵抗中的作用，明确miRNA-152和miRNA．200s调节P13K／AKT信号通路的分子机制。方法（1）以12周龄db／db小鼠作为胰岛素抵抗模型小鼠，收集小鼠肝脏组织，用miRNA芯片分析肝脏中miRNA表达谱变化，并用Real—timePCR进一步验证芯片结果。（2）10斗∥LIL-6处理小鼠肝细胞系NCTCl469和C57BL／6小鼠原代肝细胞24h，建立胰岛素抵抗的细胞模型，检测P13K／AKT信号和miRNA．152、miRNA-200s表达水平；在c57BL／6J小鼠背部皮下埋泵缓释注射IL-61周，建立IL-6诱导的胰岛素抵抗动物模型，观察肝脏中P13K／AKT信号通路和miRNA-152、miRNA-200s表达水平。（3）合成miRNA-152、miRNA-200smimics和inhibitors，并转染入NCTCl469细胞，用Real—timePCR测定细胞中miRNA-152和miRNA．200S的水平，并且检测P13K／AKT信号通路和糖原水平。（4）用生物信息学方法预测miRNA-200s的下游靶基因；以Westernblot分析miRNA-200s对下游基因FOG2和PTEN表达的影响。（5）利用siRNA干扰FOG2和lrFEN的表达，检测P13K／AKT信号通路和糖原合成水平。结果（1）与对照组小鼠相比，12周龄db／db小鼠的体重、血糖、血脂和血清IL-6水平明显升高。在db／db小鼠肝脏中P13K／＇AKT信号通路受到抑制，肝组织糖原含量显著降低。miRNA芯片结果显示，有31个miRNA表达升高，88个miRNA包括miRNA—t52和miRNA-200s表达下降。进一步用Real—timePCR验证芯片的分析结果，结果显示，在db／db小鼠肝组织中miRNA·152和miRNA-200s水平显著低于对照组小鼠。（2）db／db小鼠体内是多因素集合体，无法确定究竟是何种因素导致miRNA·152和miRNA-200s表达的降低。因此，我们用10¨g／LIL-6处理小鼠肝细胞系NCTCl469和小鼠原代肝细胞，以确定IL石与miRNA-152和miRNA-200s之间的关系。结果显示，在小鼠肝细胞系NCTCl469和小鼠原代肝细胞中，IL-6抑制P13K／AKT信号通路和糖原合成，并降低miRNA-152和miRNA-200s的水平。皮下缓释注射IL-61周后C57BL／6J小鼠肝脏中P13K／AKT信号通路和糖原合成受到抑制，miRNA-152和miRNA-200s水平也显著降低。（3）为了确定miRNA-200s的下游靶基因，我们用生物信息学分析预测。结果显示，在FOG2和PTEN3’-UTR上均有miRNA．200s的结合位点。Westernblot结果显示，miRNA-200s能够调控FOG2和PTEN的蛋白水平。（4）进一步确定FOG2和PTEN对胰岛素信号通路和糖原合成的影响。在NCTCl469细胞中，利用siRNA干扰FOG2和PTEN的表达。结果显示，抑制FOG2和PTEN的表达可以逆转IL-6对P13K／AKT信号通路和糖原合成的抑制作用。（5）最后，为了明确miRNA-152对miRNA．200s的调控作用，我们在NCTCl469细胞中转染miRNA-152inhibitors，Real．time结果显示，抑制miRNA．152导致miRNA-200s的水平下降。结论（1）IL-6能够降低miRNA-152和miRNA-200s水平，抑制肝细胞P13K／AKT信号通路和糖原合成。（2）miRNA-152和miRNA-200s可以逆转IL-6对肝细胞P13K／AKT信号通路和糖原合成的抑制作用。（3）miRNA-200s通过下调FOG2和PTEN的表达而调控肝细胞P13K／AKT信号通路和糖原合成。（4）miRNA-152调节miRNA-200s的表达。