人肌细胞增强因子2A基因病毒载体构建及嗜铬细胞瘤PC12稳转细胞系的建立和鉴定

摘要

目的构建表达肌细胞增强因子2(MEF2)A基因的反转录病毒载体,并观察稳定感染嗜铬细胞瘤PC12细胞后MEF2A蛋白的表达情况。方法用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA3-MEF2A-flag质粒,得到MEF2-flag基因的编码序列,定向插入到pBabe-puro载体中,经扩增、筛选阳性克隆、酶切和测序验证后,转染293T细胞进行病毒包装、扩增、纯化后获取反转录病毒颗粒。将反转录病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤霉素筛选后抗性克隆集落长出。采用Western印迹法检测MEF2-flag的表达情况。结果连接重组后经酶切和测序筛选出pBabe-MEF2A-flag。转染pBabe-MEF2A-flag的PC12的细胞组中MEF2A的含量为2.03±0.06,显著高于空载体对照组的1.00±0.04(P<0.01)。结论成功构建pBabe-MEF2A-flag反转录病毒载体,并建立了其稳定转染的PC12细胞系。