猪CD163的分子克隆、原核表达及免疫血清制备

摘要

采用生物信息学软件分析猪CD163结构,用RT-PCR从猪巨噬细胞RNA中扩增猪CD163前1 511 bp cDNA片段,再用PCR扩增抗原指数较高的697 bp cDNA片段,将其克隆入质粒载体进行序列测定;将cDNA片段克隆入含细胞毒性T细胞相关抗原4（CTLA-4）胞外区（IgV）编码序列的原核表达载体,用IPTG诱导重组菌表达;在变性条件下用镍亲和柱纯化融合蛋白,以每只50μg蛋白的剂量免疫小鼠3次,间接ELISA检测抗体效价;以表达CD163的猪巨噬细胞和不表达CD163的PK-15细胞膜为抗原,用Western blotting验证免疫血清的特异性,以获得猪CD163重组抗原和免疫血清,为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染机制研究提供检测试剂。结果表明：猪CD163的第45~297位氨基酸抗原指数较高,不含疏水性氨基酸集中区;RT-PCR扩增产物的大小与预期结果相符,与发表序列的核苷酸序列同源性为99.5%,氨基酸序列同源性为100%;重组大肠杆菌表达的CTLA-4 IgV-CD163s融合蛋白为预期的43 ku,主要以包涵体形式存在,通过亲和层析和尿素变性/复性获得了可溶性纯化蛋白;免疫小鼠血清的ELISA抗体效价为1∶300 000,能在CD163＋细胞中检测到预期的120 ku蛋白条带,而在CD163-细胞中未检测到相应的蛋白条带。结果提示获得的猪CD163重组抗原和免疫血清可用于PRRSV感染检测。