ELISA夹心法检测rhGM-CSF/IL-3融合蛋白

摘要

以往我们对在大肠杆菌中表达的rhGM-CSF/IL-3融合蛋白进行了中试纯化,同时研究还表明rhGMCSF/IL-3体外能促进造血祖细胞的生长发育(另文发表)。为进一步研究其在体内的药效,测定药代动力学,我们建立了ELISA夹心法定量检测rhGMCSF/IL-3,现报告如下。 材料与方法 1.1 主要试剂 鼠抗rhGM-CSF单克隆抗体(rhGM-CSF McAb)为自制;鼠抗rhGM-CSF多克隆抗体(rhGM-CSF PcAb)、兔抗rhIL-3多克隆抗体(rhIL-3 PcAb)、酶标记羊抗兔IgG(均购自Amersham);LPS、HRP、BSA(SIGMA);G-CSF、rhIL-3、EPO(Amgen);IL-2(Cetus);rhGM-CSF、IFN-α(均购自Schering-Plough公司)。 1.2 ELISA夹心法测定rhGM-CSF/IL-3融合蛋白 用25mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS pH8.0)按适当比例稀释的rhGM-CSF McAb 100μl包被微孔板,20℃16小时,将含(A液)0.1％Tween-20的PBS洗板至少3次,200μl 1％BSA-PBS溶液20℃封闭6小时,A液洗板,甩干,-20℃保存备用。使用时解冻,每孔加样150μl,4℃16小时;A液洗板5次,加B液(0.1％Tween-20,0.1％BSA in 50mmol/LPBS, pH7.3)适当稀释的rhIL-3 PcAb 100μl,20℃ 3小时;A液洗板5次,加100μl HRP-羊抗兔IgG,37℃1小时;