汉坦病毒S片段标准品构建及在荧光定量PCR检测中的应用

摘要

[目的]构建汉坦病毒S片段标准品,并建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量PCR方法检测汉坦病毒核酸。[方法]对76-118株的S片段基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针,逆转录为cDNA,经PCR扩增,产物纯化后与PMD 18-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5a,筛选得到标准品的质粒,提取质粒并进行定量。在S片段的保守区设计引物和TaqMan探针,对real-time PCR条件进行优化,并提取急性期发病病人总RNA,逆转录为cDNA,与标准品同时检测。[结果]该方法制备的质粒标准品应用于汉坦病毒早期检测,能对检测样品进行质量控制;应用荧光定量PCR检测急性期病人病毒含量,具有高特异性和灵敏度,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,重复性好,并能对病毒准确定量。[结论]汉坦病毒荧光定量标准品和TaqMan荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适用于汉坦病毒的早期检测;汉坦病毒S片段编码的核衣壳蛋白(NP)是流行性出血热早期诊断的理想抗原。