串珠镰刀菌伏马菌素产毒株聚合酶链反应检测方法的研究

摘要

以伏马菌素生物合成所必需的多酮肽合成酶基因fum5为基础 ,设计了 3对特异性引物P1 P2、P3 P4和Fum5F2 1 Fum5 1,建立了串珠镰刀菌伏马菌素产毒株PCR检测方法。以 5株ATCC典型串珠镰刀菌及其他菌株为参考 ,其中ATCC 5 2 5 3 9为伏马菌素B1(FB1)产毒株 ,测定了PCR方法的特异性。ATCC 5 2 5 3 9扩增结果阳性 ,该 3对引物分别扩增出 880bp、70 2bp和 10 40bpDNA片段 ,非伏马菌素产毒株ATCC 3 8946、ATCC2 62 63、ATCC 12 763、ATCC 3 80 16及其他阴性对照菌株 (禾谷镰刀菌、梨孢镰刀菌、木贼镰刀菌、三线镰刀菌、黄曲霉、拟青霉和大肠杆菌O15 7)结果阴性 ,证明引物具有很好的特异性。同时以不同稀释度的ATCC 5 2 5 3 9DNA为模板 ,测定了 3对引物PCR的敏感性 ,P1 P2每PCR反应的检出限为 10 0pg ,P3 P4和Fum5F2 1 Fum5R1每PCR反应的检出限均为 10pg ,分别相当于每PCR反应检出 10 4和 10 3个孢子。 3对引物PCR检测国内不同地区分离的 3 2株串珠镰刀菌及交孢变种 ,2 6株为伏马菌素产毒株 ,6株为非伏马菌素产毒株。并对部分产毒株PCR(P3 P4)产物 ,应用内切酶EcoRV和BamHI,进行限制片段长度多态性 (RFLP)分析 ,分别产生 181bp、5 2 1bp 2个和 116bp、2 5 8bp、3 2 8bp 3个DNA片段 ,与文献报道值一致 。