nm23-H1基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建

摘要

目的:制备用于nm23-H1基因mRNA实时荧光定量PCR检测的质粒标准品。方法:通过PCR扩增出目的片断,纯化后T-A连接至pMD18-T载体,转化宿主菌E.coliDH5α,获得阳性克隆;通过PCR扩增、双酶切鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确;大量抽提重组质粒,测定其拷贝浓度,10倍稀释成梯度标准品,并进行荧光定量PCR检测分析。结果:nm23-H1基因目的片段成功重组至pMD18-T载体上,获得的重组质粒保持了目的片段的特异性和序列完整性。梯度浓度标准质粒的荧光定量PCR结果显示,循环阈值(C t)与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系。结论:成功构建了nm23-H1基因实时荧光定量PCR质粒标准品。