弓形虫复合基因疫苗pcSAG1-ROP5诱导小鼠免疫应答的研究

摘要

目的观察弓形虫复合基因疫苗pcSAGl-ROP5免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法构建弓形虫重组真核表达质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5，分别通过PCR、酶切和测序鉴定后，转染人宫颈癌细胞（HeLa细胞），蛋白印迹（Westernblotting）分析重组蛋白的体外表达情况。70只昆明小鼠随机均分为5组（每组14只），分别为pc-SAGl组、pcROP5组、pcSAGl-ROP5组、空质粒组和空白对照组。重组质粒组每次每只肌注100μg重组质粒，每2周免疫1次，共3次。空质粒组和空白对照组分别注射等量的空质粒和PBS。于每次免疫前和末次免疫后2周眼眶采血。制备血清。采用ELISA法检测pcSAGl-ROP5组小鼠末次免疫后2周的血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价，以及5组小鼠的各次血清中抗弓形虫抗体IgG水平。末次免疫后3周，每组小鼠取10只腹腔接种10s弓形虫速殖子，观察生存时间。末次免疫后4周，采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中r干扰素（IFN-r）和白细胞介素4（IL-4）的水平。结果重组真核表达质粒构建成功。Westernblotting分析结果显示，重组质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5均能在HeLa细胞中表达，重组蛋白的相对分子质量（尬）分别为31000、57000和88000。pcSAGl-ROP5组小鼠血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价分别为1：320、1：160和1：2560。3个重组质粒组小鼠血清抗弓形虫IgG抗体水平随着免疫次数的增加和时间的延长逐渐升高，末次免疫后2周，pcSAGl-ROP5组小鼠血清IgG抗体水平（0．612±0．031）显著高于其他各组（P〈0．05）。攻击感染后，pcSAGl-ROP5组小鼠的平均存活时间为（288±7）h，较pc—SAGl组和pcROP5组分别延长了48h和96h（P〈0．05）。末次免疫后4周，pcSAGl-ROP5组小鼠脾细胞培养上清中IFN-1水平[（908．52±6．31）pg／m1]显著高于其他各组（P〈0．05），各组的IL-4水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论与弓形虫单基因疫苗pcSAGl和pcROP5相比，复合基因疫苗pcSAGl-ROP5所诱导的抗弓形虫IgG抗体和IFN-1水平较高，攻击感染后存活时间延长。