美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及变应原活性测定

摘要

目的克隆美洲大蠊(Periplaneta americana)精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因并表达、纯化具有变应原活性的重组AK。方法提取美洲大蠊总RNA,设计特异引物,通过RT-PCR克隆美洲大蠊AK基因目的片段,测序后将该片段克隆入原核表达载体pET-28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获重组AK。用镍离子(Ni2+)亲和层析柱纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组AK表达情况。用蛋白质印迹分析(Western blotting)(变性条件)和ELISA(非变性条件)检测重组AK变应原与过敏患者血清IgE结合活性,并以健康人血清为对照。结果测序结果表明,AK基因含有1068bp的开放阅读框,编码356个氨基酸(登录号为EU429466)。与Gen Bank公布的序列(登录号为AY563004)比较同源性达99.9%。SDS-PAGE分析表明,该变应原基因在E.coli中主要以可溶形式高水平表达,相对分子质量约为Mr45000。重组变应原AK在变性与非变性条件下,与过敏患者血清IgE均具有良好的结合活性,与健康人对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论获得了具有变应原活性的重组美洲大蠊精氨酸激酶。