miR-27a调控PI3K/AKT通路介导的自噬途径减轻脂多糖诱导的人肺腺癌细胞A549凋亡

摘要

目的探究微RNA-27a(microRNA-27a,miR-27a)调控磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人肺腺癌细胞株A549凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法Starbase分析miR-27a与磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基δ(phosphatidylinositol-3 kinase catalytic subunit delta,PIK3CD)存在互补的结合位点,并以双荧光素酶验证。将A549细胞分为正常组、LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组。LPS+miR-27a模拟物阴性对照组、LPS+miR-27a模拟物组、LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组分别转染miR-27a模拟物阴性对照、LPS+miR-27a模拟物、LPS+miR-27a模拟物,培养细胞6 h,更换为完全培养液培养细胞24 h,然后除正常组外,其余各组细胞添加10 mg/L LPS刺激24 h,且LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组加入PI3K激活剂740 Y-P,正常组细胞完全培养液正常培养相同时间。实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞中miR-27a表达水平;细胞计数试剂盒8检测细胞增殖情况;Hoechst33342染色与流式细胞术检测细胞凋亡情况;透射电镜观察A549细胞自噬;蛋白免疫印迹检测细胞中PIK3CD、磷酸化AKT(phosphorylated-AKT,p-AKT)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(microtubule-associated protein 1light chain 3 II,LC3Ⅱ)蛋白表达。结果miR-27a与PIK3CD存在结合位点,并经双荧光素酶验证。与正常组相比,LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组A549细胞中miR-27a表达水平、增殖率、Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05),凋亡率、细胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平升高(P<0.05);分别与LPS组、LPS+miR-27a模拟物阴性对照组相比,LPS+miR-27a模拟物组A549细胞中miR-27a表达水平、增殖率、细胞中Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05),凋亡率、细胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平降低(P<0.05);与LPS+miR-27a模拟物组相比,LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组细胞中miR-27a表达水平、增殖率降低(P<0.05),凋亡率、细胞中PIK3CD、p-AKT、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平升高(P<0.05)。正常组细胞数量较多,细胞间排列紧密,可见核大小均一,细胞器结构正常;LPS组和LPS+miR-27a模拟物阴性对照组可见细胞变圆,细胞核固缩,形成团块现象,显现多个大小不一的圆形自噬泡;LPS+miR-27a模拟物组核固缩细胞数降低,LPS+miR-27a模拟物+PI3K激活剂组核固缩细胞数较LPS+miR-27a模拟物组升高,均可见少量圆形自噬泡,但数目不一。结论高表达miR-27a可以抑制PI3K/AKT通路,从而减轻LPS诱导的人肺腺癌细胞A549凋亡,而这一途径可能与自噬减少相关。