应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法

摘要

目的应用双启动寡核苷酸引物（Dual Priming Oligonucleotide,DPO）技术建立同时检测日本脑炎病毒（JapaneseEncephalitisVirus,JEV）、黄热病毒（YellowFeverVirus,YFV）、西尼罗病毒（WestNileVirus,WNV）、圣路易斯脑炎病毒（St.Louis encephalitis virus,SLEV）和登革病毒（Dengue virus,DV）5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法。方法利用Primer Premier5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性。结果应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142 bp、293 bp、377 bp、630 bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5 000 PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105copies/μl、2.6×104copies/μl和1.37×104copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应。结论应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测。