一种新的分化心肌细胞筛选策略:稳定表达αMHC-Bla^r-2A-EGFP-Rex-mCherry-2A-neo融合基因的人胚胎干细胞系的建立及其向心肌细胞定向分化的鉴定

摘要

心肌梗死是威胁人类健康的重要疾病之一,胚胎干细胞来源的心肌细胞移植是目前治疗心肌梗死的研究热点.但是由于受到分化的心肌细胞纯度的影响,限制了心肌分化的机理研究以及临床应用.本实验构建含有心肌特异性启动子α-MHC启动的灭瘟素(Blasticidin,简称Blar)抗性基因及增强绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒表达载体αMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-mCherry-2A-neo.应用慢病毒转染技术将慢病毒转染到人胚胎干细胞(hESCs),胚胎干细胞特异性启动子Rex启动mCherry和neo抗性蛋白的表达.经过G418药物筛选,建立G418和mCherry阳性的细胞系.通过PCR及流式细胞术,进一步鉴定稳定转染的hESCs细胞系;核型分析表明,该细胞系在建立过程中仍保持细胞核型的稳定.在诱导稳定转染的hESCs向心肌细胞分化的实验中,分化的心肌细胞表达心肌细胞特异的肌钙蛋白(cTnT),同时具有EGFP和Blasticidin药物筛选的双标记.本实验建立的这一细胞系可用于心肌细胞的纯化,为深入研究心肌发生发育的关键调控机制及临床应用奠定基础.