环介导等温扩增技术在转基因杨树检测中的应用

摘要

随着转基因技术的成熟,转基因生物越来越多,关于转基因生物的争议也越来越受到人们的关注。建立一套能够简便、快速、准确的检测转基因林木的外源基因技术,对转基因林木的研究有重要意义。采用灵敏、快速的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,建立一套以Bt Cry1Ac或Npt II基因为靶标的转基因林木的检测方法。针对靶标基因的6个区域设计4种特异引物,优化LAMP-PCR反应体系中的各个成分,根据直接观察产物中焦磷酸镁的沉淀情况、Gold View核酸染色剂对其产物染色情况来判断反应结果并与将产物经过1%琼脂糖电泳的情况进行对比。比较LAMP-PCR和常规PCR两种不同检测方法的灵敏度。对转基因杨树不同无性系中多种外源基因进行检测。筛选出了最佳的引物,确定出了最优的反应体系:3 mmol/L Mg2+、1.4 mmol/L Bst、1.4 mol/L Betaine、7:1的10μmol/L内外引物比、2μL10 mmol/L d NTP、以及2μL浓度为200 ng/μL的DNA模板。在PCR仪65℃等温条件下保温90 min,可直接观察到焦磷酸镁的白色沉淀;经过Gold View核酸染色剂染色,可在紫外灯下观察到荧光绿色;经过1%琼脂糖电泳的检测,可观察到清晰的弥散状条带。通过对比试验得出LAMP-PCR的灵敏度比常规PCR要高。对实验室多个转基因杨树无性系目的基因的检测,证明了LAMP-PCR在转基因林木外源基因检测中的较高可靠性。本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测转基因林木,建立了一套更简便、灵敏、快速、可靠的转基因林木的LAMP-PCR检测方法。该技术在恒温65℃的条件下保温90 min即可完成转基因林木的检测,既节省了时间,又降低了成本,为转基因林木的检测研究提供了一种新的技术。