新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR检测方法的假病毒阳性对照品制备

摘要

目的制备安全、稳定的新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR检测阳性对照品。方法人工合成含实时荧光RT-PCR扩增片段的新疆出血热病毒核苷酸序列,连接入慢病毒载体,将重组慢病毒载体与慢病毒包装载体共转染293T细胞,培养48 h后采用实时荧光RT-PCR方法检测假病毒包装情况,随后将包装成功的假病毒颗粒加核酸保护剂制备成阳性对照品,并进行稳定性试验。结果重组慢病毒载体与慢病毒包装载体共转染293T细胞后,将收集到的细胞培养上清采用实时荧光RT-PCR进行检测,结果显示10、100、1 000、10 000倍4个倍比稀释度扩增后所得的Ct值分别为13、19、25、33,显示含高浓度的假病毒颗粒。取经1 000倍稀释后制备的阳性对照品于37℃孵箱中放置0、3、7、15、21和30 d后,提取的RNA经实时荧光RT-PCR检测,所得Ct值在25~28之间,表明阳性对照品有较高的热稳定性。结论本研究通过慢病毒包装技术制备的假病毒颗粒,是新疆出血热病毒荧光RT-PCR核酸检测过程中理想的阳性对照品。