蛋白磷酸酶2A催化亚基异构体过表达细胞株的构建和鉴定

摘要

目的克隆PP2Acα异构体(PP2Acα2)并分析该基因结构,构建PP2Acα2和PP2Acα载体并建立高表达细胞株。方法诱导HL-60细胞表达PP2Acα2,克隆PP2Acα2和PP2Acα使用pCMV-Tag4A真核表达载体构建重组质粒。通过转染建立高表达细胞株,RT-PCR和蛋白免疫印迹实验检测其PP2Acα2、PP2Acα基因和蛋白水平,使用细胞计数法检测细胞株生长曲线和流式细胞仪检测细胞周期。蛋白免疫印迹实验检测免疫球蛋白结合蛋白1(IGBP1)在构建成功的细胞中的改变。结果经过测序鉴定PP2Acα2和PP2Acα重组质粒构建成功,PP2Acα2为PP2Acα剪切异构体缺失第五外显子。RT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示成功构建表达PP2Acα和PP2Acα2的HEK293细胞株。转染后的细胞生长曲线和细胞周期未发生明显改变。IGBP1在转染了PP2Acα2的HEK293细胞株中表达量分别是Vetor组和PP2Acα组的2.2倍和1.5倍。结论成功克隆了PP2Acα2基因并构建了重组质粒,成功构建了高表达PP2Acα2细胞株。为阐明PP2Acα2的作用机制及其生物学效应提供了可靠的平台。