刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶基因的克隆及原核表达

摘要

目的克隆刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶(TgPDI)基因,原核表达、纯化重组TgPDI蛋白,并分析其免疫反应性。方法制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgPDI基因全长编码序列(登录号为AJ306291.2)的开放阅读框设计合成引物,并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经双酶切后连接入pET-30a(+)载体,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切并测序鉴定。将重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3),并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗His抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白及其免疫反应性;重组蛋白His-TgPDI通过Ni2+琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化,纯化蛋白经SDSPAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度。结果 RT-PCR扩增产物约为1 427 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得约57 kDa的可溶性重组蛋白。Western blotting结果表明,诱导表达的重组蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。亲和纯化后获得纯度大于95%的重组TgPDI蛋白质。结论克隆得到弓形虫PDI基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白,且该重组蛋白具有免疫反应性。