C4植物PEPC酶的单克隆抗体制备和双夹心ELISA检测方法的建立

摘要

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPCase)是高等植物尤其是C4植物进行光合作用的一种关键酶,利用PEPC基因提高C3植物的光合效率具有重要的应用前景。本研究利用来源于玉米PEPCase免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经筛选克隆,得到3株能稳定分泌抗PEPCase的单克隆抗体杂交瘤细胞,并制备腹水型单抗。利用其中一株杂交瘤细胞4E5的小鼠腹水单抗和PEPCase的兔源多抗,建立检测PEPCase的多抗一待检样品一单抗模式的双夹心酶联免疫吸附检测方法(enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA)。检测条件经过优化后分别为:兔源多抗以1:3 200稀释,单抗4E5以1:800稀释,整个操作过程仅需要5个小时(不含包被和封闭时间),本方法能够长期保存。利用建立的双夹心ELISA检测方法检测验证转玉米PEPC基因水稻,在经PCR分子检测后证实携带PEPC基因的305株样品中,有237株为阳性单株,阳性率为77.7%,符合率较高。实验表明,本研究能够为育种上快速筛选转PEPC基因作物提供了一种更加简单、快速、灵敏的检测方法。