内源性表位标记的H1FX细胞系构建及其染色质分布图谱

摘要

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)基因组编辑技术对内源性H1FX进行表位标记来执行染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq),探究前列腺癌22Rv1细胞中H1FX在基因组上的结合位点及分布规律。方法以质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9为载体,设计特异性向导RNA(gRNA),构建pX330-H1FX重组质粒,引导Cas9核酸酶至接近H1FX终止密码子的位置处进行切割。以含有3×FLAG表位标签、自剪切多肽2A和遗传霉素耐药基因序列的质粒pFETCh_Donor为载体,序列两侧添加与双链断裂两侧区域同源的同源臂(HOMO),构建pFETCh_Donor-HOMO重组质粒。将pX330-H1FX重组质粒和pFETCh_Donor-HOMO重组质粒共转染到前列腺癌22Rv1细胞中,切割DNA并通过同源重组修复的方式整合表位标签。48 h后使用含遗传霉素的培养基筛选细胞。筛选出内源性表位标记的H1FX-FLAG细胞系后使用FLAG抗体进行ChIP。对ChIP富集的DNA和给料对照(Input)DNA进行建库,建库合格后送测序。后续对H1FX ChIP-seq数据与基因表达数据进行整合分析。结果Western blotting结果显示,筛选到只表达H1FX-FLAG融合蛋白的细胞系;聚合酶链反应结果显示,FLAG表位标签整合至基因组正确的位置;测序结果显示,插入序列及接头处序列正确,内源性表位标记的H1FX-FLAG细胞系构建成功。H1FX ChIP-seq数据与基因表达数据整合分析发现,高表达基因的启动子区域更倾向于缺乏H1FX的结合。结论成功构建了内源性表位标记的H1FX-FLAG细胞系,初步分析了前列腺癌22Rv1细胞中H1FX在基因组上的结合位点及分布规律,为进一步研究H1FX在前列腺癌中的作用提供参考。