乙肝患者血清中HBV cccDNA荧光定量检测方法的优化

摘要

目的:通过实验验证并建立一种用荧光定量PCR技术准确检测血清中HBV cccDNA的方法,同时能够消除HBV rcDNA非特异性扩增的干扰。方法:用两步法提取20例乙肝患者血清中的total HBVDNA,分别用荧光PCR试剂盒定量检测HBV DNA和cccDNA。然后通过质粒保护型的DNA酶对提取的DNA模板进行消化处理,使rcDNA得到一定程度的降解后,再分别进行HBV DNA和cccDNA的定量检测。结果:未经过酶消化处理直接定量cccDNA时存在一定的非特异性扩增。这种非特异性扩增在HBV DNA含量>106copies/ml时比较明显,消化前后cccDNA定量值的对数平均相差1.94。经过酶消化后的定量cccDNA值基本消除了rcDNA非特异性扩增的干扰。结论:通过质粒保护型的DNA酶降解rcDNA后再进行cccDNA检测是一个方便可行的解决cccDNA准确定量问题的方法,非特异性干扰几乎可以完全消除。血清cccDNA与HBeAg及HBV-DNA有关,提示它可能也是HBV复制的血清标志。乙肝患者血清中cccDNA的含量与total HBV DNA含量成正相关。