快速筛选高水平稳定表达成纤维细胞生长因子-21真核细胞株新方法的建立

摘要

成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员,其研究已成为世界糖尿病研究的新热点,并有望成为治疗2型糖尿病的新型药物.然而,应用真核表达系统,更加快速、高效生产更接近天然状态的FGF-21蛋白并对其生物学功能进行的研究,至今尚未报道,因此建立高效稳定的FGF-21真核表达系统至关重要.本研究以FGF-21为目的基因,利用谷氨酰胺合成酶基因(GS)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,分别构建了单基因表达载体Pee12.4-FGF-21-Pee6.4-EGFP(Peedual)、Pee12.4-FGF-21-IRES-EGFP(PeeIRES)和双基因的真核表达载体Pee12.4-FGF-21-IRES-EGFP-Pee6.4-FGF-21(Peedual-IRES),分别转染CHO-K1SV细胞后,通过GS加压和流式细胞术(在488 nm波长的激发光下能检测到EGFP绿色荧光)双筛选系统快速有效获得了稳定高效表达目的蛋白的细胞系.应用SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测细胞系目的蛋白的表达及差异,并通过HepG-2细胞糖吸收模型进行蛋白活性检测.研究结果表明:两个筛选系统结合使用,更好更快地筛选到了稳定转染并高效表达目的蛋白的细胞系,而且与单基因的载体相比,双基因载体Peedual-IRES在操作条件一致的情况下,目的蛋白表达量显著提高且均具有生物活性.本研究建立了省时、高效的真核表达平台,为FGF-21在真核水平上的高表达提供了一个新的方法.