CRISPR/Cas9载体优化及CHD1L条件性敲除肝癌细胞系的构建

摘要

目的利用优化的pLV-Tet3G-CRISPR/Cas9载体系统构建条件性敲除CHD1L的QGY-7703肝癌细胞系,验证敲除效果及其对细胞生物学的影响,为研究CHD1L促肿瘤细胞恶性表型机制提供重要的细胞模型。方法用点突变方法优化pLV-Tet3G-Cas9载体以降低其脱靶效应,进而将Cas9改造成eSpCas9;其次,通过筛选获得稳定表达eSpCas9的QGY-7703细胞株;将mCherry基因插入载体pLVXhU6-SgRNA中,获得携带mCherry荧光基因的pLVX-mCherry-hU6-SgRNA载体;设计和筛选特异性靶向CHD1L的SgRNA序列,用重叠PCR方法获得hU6-CHD1L-SgRNA片段,筛选具有CHD1L切割活性的靶点,随后,将其克隆到pLVX-mCherry-hU6-SgRNA载体中;用293FT细胞进行病毒包装,获得慢病毒颗粒;转染7703eSpCas9细胞株,利用Western blot验证Dox诱导下的CHD1L敲除效果,划痕和Transwell实验检测Dox诱导的CHD1L敲除对肝癌细胞生物学功能的影响。结果 pLV-Tet3G-Cas9载体Cas9成功优化为eSpCas9序列;成功构建pLVX-mCherry-hU6-CHD1L-SgRNA载体;通过转染及筛选,获得Dox诱导的CHD1L敲除QGY-7703肝癌细胞系;细胞实验显示Dox可诱导eSpCas9表达,靶向性切割CHD1L,抑制QGY-7703细胞的迁移侵袭。结论成功构建Dox诱导的CHD1L敲除肝癌细胞株,此载体系统可为靶向肿瘤特异性基因研究提供细胞模型。