双峰驼TLR2多克隆抗体的制备及其在免疫组化检测中的应用

摘要

为了制备兔抗双峰驼Toll样受体2(TLR2)的多克隆抗体并鉴定其活性,试验选择双峰驼TLR2基因序列,选取编码区,经软件分析预测该区域编码蛋白的主要氨基酸抗原位,选择对应的核苷酸序列进行基因合成,构建双峰驼TLR2重组质粒(pET28a-TLR2);通过原核表达系统诱导pET28a-TLR2表达,并优化异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)表达条件;表达的蛋白溶解变性后,与Ni-NTA镍柱填料结合,经亲和层析法纯化,用纯化后的蛋白免疫新西兰白兔并制备多克隆抗体;利用SDS-PAGE鉴定蛋白表达和纯化情况,间接ELISA试验、Western blot检测及免疫组化验证并评价多克隆抗体的效价与反应性。结果表明:成功表达双峰驼TLR2重组蛋白,大小约为64 kDa,最佳诱导表达条件:IPTG浓度为0.4 mol/L、诱导时间为5 h,蛋白质以包涵体的形式表达;抗体效价为1∶256 000,能特异性识别目的蛋白;在双峰驼十二指肠肠系膜淋巴结和脾脏中,抗体能特异性识别双峰驼TLR2阳性细胞,细胞类型以单核/巨噬细胞为主,具有良好的特异反应性。说明成功制备的兔抗双峰驼TLR2多克隆抗体具有良好的特异反应性并能用于TLR2的免疫组化检测。