微囊藻毒素降解酶MlrA的结构功能分析

摘要

MlrA(亦称microcystinase)是微囊藻毒素(microcystins,MCs)细菌降解途径中负责催化起始反应的关键蛋白酶,其结构特征与底物水解机制尚未明确.使用折叠识别法构建MlrA分子模型,通过分子对接和定点突变分析了酶-底物的结合方式与相互作用,结合蛋白重组表达对酶活性影响机制等进行了探究.结果表明MlrA是定位于细菌细胞质膜的整合膜蛋白,主要由8个跨膜α-螺旋(TM1～8)组成,功能结构域ABI(TM4～7)形成向周质空间开放的底物反应空腔.MlrA催化残基(E172、H205、H260和N264)位于膜内,其侧链投射至反应腔内部.微囊藻毒素LR(MC-LR)采用β-发夹构型与酶结合并将易裂键暴露于水分子附近,其水解机制为E172和H205通过一般碱催化将水分子去质子化激活,对Adda-Arg肽键羰基碳进行亲核攻击;接着H260和N264构成氧阴离子穴以稳定过渡态氧阴离子;最后H205或E172催化胺离去基团发生质子化,使四面体氧阴离子中间体崩解.此外,MlrA不是金属蛋白酶,无法与金属离子(Ⅱ)配位结合,菲咯啉类化合物使酶分子发生非特异性解折叠而失活,EDTA对底物结合位点具有竞争作用.本研究揭示了MlrA的属性与水解机制,为进一步探索MCs微生物降解机理提供一定参考依据.