罗布麻总黄酮通过PI3K/AKT/GSK3β抑制H2O2诱导的EA.hy926凋亡机制研究

摘要

目的研究罗布麻总黄酮（TFF）对H2O2诱导的人脐静脉融合细胞EA.hy926凋亡的保护作用,并探讨其可能的作用机制.方法MTT法检测细胞存活率、凋亡检测试剂盒测定细胞凋亡率、Hoechst33342/PI荧光双染观察细胞形态变化,JC1染色检测细胞线粒体膜电位的变化;Westernblot检测凋亡相关蛋白Mcl-1、cleavedcaspase-3、cleavedcaspase9及给药组与加抑制剂组AKT、GSK3β蛋白表达和磷酸化水平;荧光定量PCR检测各组GSK3β、Mcl-1、cleavedcaspase-3、cleavedcaspase9mRNA的表达.结果与对照组相比,模型组细胞存活率降低、凋亡率升高、线粒体膜电位降低,与模型组相比,TFF各剂量组（9mg·L^-1、18mg·L^-1、36mg·L^-1）细胞存活率明显增加（P〈0.05）,线粒体膜电位升高（P〈0.05）;Westernblot结果,与模型组相比,TFF各剂量组的Mcl-1蛋白表达升高,而cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9蛋白表达量降低（P〈0.05）,与正常组相比,单独给药TFF各剂量组使通路中的AKT、GSK3β磷酸化水平增高,而加PI3K抑制剂LY294002后,与给药组相比AKT及GSK3β磷酸化水平均降低（P〈0.05）;荧光定量PCR结果,与模型组相比,随着给药剂量的增加Mcl-1的mRNA表达逐渐增高,而cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9、GSK3β的mRNA表达降低.结论罗布麻总黄酮对H2O2诱导的EA.hy926细胞损伤有明显的保护作用,其主要作用机制可能是通过激活PI3K/AKT/GSK3β通路,增加AKT、GSK3β的磷酸化,减少Bcl-2家族抗凋亡蛋白Mcl-1的泛素化降解,进而抑制基于caspase家族的线粒体凋亡,发挥细胞保护作用.