快速检测细菌并革兰分型的半巢式聚合酶链反应及其初步应用

摘要

目的以半巢式聚合酶链反应(PCR)检测细菌及作革兰阴、阳性分型,并与细菌培养法比较.方法以细菌16S rRNA基因为靶序列,采用一对通用引物(pm1, pm3)和一条革兰阴性型特异性引物(pm2),以半巢式PCR方法扩增实验室保留菌株的DNA并作出革兰染色分型;以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV-DNA阳性血清以及白假丝酵母菌为对照,检测此方法的特异性;采用倍比稀释菌液作敏感性实验;与细菌培养法比较,验证此方法检测临床标本的敏感性. 结果对17个实验室保留菌株进行检测,以通用引物对作第1次PCR均得到371 bp长度的DNA片段;再以革兰阴性菌特异引物对(pm2, pm3)作第2次PCR,9种阴性菌均得到353bp的DNA片段,而8种阳性菌未被扩增.特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应.敏感性实验表明,采用半巢式PCR可检测出3个CFU的细菌.对120份临床标本检测,半巢式PCR检测阳性率(29.2%)显著高于细菌培养法检测阳性率(17.5%). 结论此半巢式PCR检测细菌方法,具有特异、敏感、快速的特点,并能对细菌进行革兰阴性、阳性分型,可用于临床感染性疾病的初步诊断.