内纵外螺旋双层结构管状尿道支架复合体修复尿道缺损的可行性及其血管化方法

摘要

目的研究内纵外螺旋双层结构的管状尿道支架复合体血管化的方法,探讨采用其修复长段尿道缺损的可能性。方法 2014年8月至2015年10月选取雄性新西兰大白兔附睾旁脂肪,分离培养脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSC）及经过转化的平滑肌细胞为种子细胞,并采用重组血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因慢病毒转染。以小肠黏膜下层脱细胞基质和经过Ⅰ型胶原蛋白表面修饰的聚乳酸乙酸共聚物（polylactic-coglycolic acid,PLGA）膜为组织工程材料,构建内纵外螺旋双层结构的管状尿道支架,支架长度3.0cm。采用一次沉淀法将转染的ADSC和平滑肌细胞分别种植于尿道支架的内外层,构建管状尿道支架复合体。抽签法将27只清洁级雄性新西兰大白兔分为转染组（S1组）、带血管蒂转移皮管组（S2组）、单纯支架组（C组）,每组9只。手术切除3.0 cm尿道构建尿道缺损动物模型。S1组采用尿道支架复合体直接修复尿道缺损;S2组将未转染慢病毒的ADSC和平滑肌细胞种植尿道支架后,包埋于实验动物腹股沟皮下血管旁,3周后采用带血管蒂转移皮管修复尿道缺损;C组直接采用尿道支架修复尿道缺损。术后4、8、24周分别选取每组各3只观察记录并发症发生情况和尿道造影检查结果,处死动物后留取修复段尿道标本行形态观察、扫描电镜观察以及HE、荧光示踪和相关蛋白免疫组化染色检查。结果 S1组术后尿瘘、尿道下裂及尿道狭窄相关性死亡各1只;尿道造影检查示尿道光滑通畅、粗细较均匀;病理检查见尿道黏膜修复良好,较平整光滑。S2组术后尿瘘和尿道狭窄相关性死亡分别为1只和2只;尿道造影示尿道壁粗糙、局部变细或扩张;病理检查见尿道黏膜下多量脂肪堆积,黏膜收缩。C组术后尿瘘、尿道下裂、尿道狭窄相关性死亡分别为1、3、3只;尿道造影示尿道粗细不均、弯曲狭窄,尿道黏膜修复不良,瘢痕狭窄。HE及CD31染色结果示S1、S2组尿道毛细血管增生活跃,血管形成丰富;C组血管形成较少。VEGF染色结果示3组的尿道上皮细胞层、平滑肌层及血管壁内皮细胞胞质均有充分表达,术后24周时表达减弱,以上皮细胞层减弱明显。CKpan染色结果示S1、S2组尿道从单层上皮发展为复层上皮,24周时形态结构类似正常尿道;C组尿道上皮细胞生长不良,层次单一、排列不整齐,术后24周时仍缺乏有效复层上皮。HE及α-SMA染色结果示S1、S2组平滑肌及肌动蛋白随时间逐渐增加;C组α-SMA着色稀少,术后24周时有所增加。HE及扫描电镜检查4周时显示PLGA被周围组织包裹,静电纺丝结构清晰;8周时PLGA明显吸收,静电纺丝逐渐降解;24周时PLGA不易发现,静电纺丝降解较完全。结论重组VEGF基因慢病毒载体转染种子细胞是促进管状尿道支架血管化的有效方法之一。内纵外螺旋双层结构的管状尿道支架复合体可能是修复长段尿道缺损较合理的构建方式。